發(fā)布時(shí)間：2020-08-21 04:43

【摘要】：隨著生活水平的提高,食品安全問(wèn)題日益受到人們的關(guān)注,果蔬中農(nóng)藥的殘留對(duì)人體健康構(gòu)成威脅,為解決這一問(wèn)題,可以通過(guò)微生物發(fā)酵的方法來(lái)降解農(nóng)藥。本文主要研究有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的篩選、菌株培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化、有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶的分離提純、酶學(xué)性質(zhì)研究及其基因研究。利用96孔板法從長(zhǎng)期噴灑農(nóng)藥的耕地土壤中篩選出能高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的菌株,并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定,結(jié)果表明:篩選的菌株為膠紅酵母菌(Rhodotorula muciaginosa),命名為RM-DY21,利用紫外分光光度法測(cè)定菌株RM-DY21在32 h內(nèi)對(duì)毒死蜱(50mg/L)降解率可達(dá)70.04%,在以毒死蜱為唯一碳源的培養(yǎng)基中,RM-DY21生長(zhǎng)較好,氧樂(lè)果次之,敵百蟲(chóng)中較少,故說(shuō)明菌株RM-DY21可以廣泛降解有機(jī)磷農(nóng)藥。為提高Rhodotorula mucilauginosa RM-DY21對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解率,通過(guò)單因素及響應(yīng)曲面分析,對(duì)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)確定了Rhodotorula mucilaginosa RM-DY21最優(yōu)培養(yǎng)基配方為:乳糖20.0g/L,硫酸銨20.0g/L,酵母浸粉10.0g/L,Ca2+、Mg2+、Zn2+的添加量分別為 0.8、0.6、0.8 mg/20mL 發(fā)酵液;利用 Design-expert 8.0軟件進(jìn)行Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理分析實(shí)驗(yàn),確定初始pH 5.0,溫度30℃,培養(yǎng)36 h時(shí),Rhodotorula mucilotonosa RM-DY21對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解率可達(dá)到83.86%,比優(yōu)化前提高了 10.62%,為后續(xù)菌株產(chǎn)酶研究的相關(guān)試驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株Rhodotorula mucilaginosa RM-DY21所產(chǎn)有機(jī)磷降解酶進(jìn)行定位,并采用鹽析及柱層析的方法對(duì)有機(jī)磷降解酶進(jìn)行了分離純化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Rhodotorula mucilaginosa RM-DY21菌株所產(chǎn)生的有機(jī)磷降解酶為胞外酶;通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀,得到降解酶鹽析范圍為60%～80%(w/v);透析并濃縮后,用SephadexG-100葡聚糖凝膠進(jìn)行層析,得到有機(jī)磷降解酶的比酶活為350.63 U/mg;再次透析濃縮后,用DEAE SepharoseFastFlow柱層析,0.2～0.5mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫,收集酶液測(cè)其比酶活為693.94 U/mg;通過(guò)SDS-PAGE變性凝膠電泳確定Rhodotorula mucilaginosa RM-DY21所產(chǎn)的有機(jī)磷降解酶分子量約40kDa。酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn),有機(jī)磷降解酶的反應(yīng)溫度為30～50℃,其最適反應(yīng)溫度為40℃;保存溫度在-20℃下最佳;反應(yīng)pH為7～9,最適pH為8;最適反應(yīng)時(shí)間為30 min;最適酶添加量為20 μL。不同金屬離子對(duì)有機(jī)磷降解酶的活性有不同的影響,0.2mmol/L的Na+、Zn2+對(duì)降解酶有較強(qiáng)的激活作用,而Ca2+、Mg2+的激活作用較弱;同濃度Li+、K+、Mn2+、Ag+對(duì)降解酶有較強(qiáng)的抑制作用,而Cu2+、Fe3+、Fe2+抑制作用較弱;異丙醇、丙酮對(duì)酶活性有抑制作用,乙醇隨著濃度的升高激活作用增加;高濃度的甲醇有微弱提高酶活作用,并測(cè)得其動(dòng)力學(xué)參數(shù) Km=24.213 μmol·L-1,Vmax=18.553 μmol·(mg·min)-1。參照GenBank中已收錄的有機(jī)磷降解酶基因序列,利用VectorNTI 10軟件分析并設(shè)計(jì)了 2對(duì)特異性引物,對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的產(chǎn)有機(jī)磷降解酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序,并利用相應(yīng)軟件對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析。測(cè)序結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)菌株的有機(jī)磷降解酶基因序列與其他多種菌株的一致性較高,該opd基因含1155個(gè)核苷酸,編碼384個(gè)氨基酸,OPD蛋白的分子式為C1830H2944N530O540S11,分子量約為41363.39 Da,為疏水性穩(wěn)定蛋白,等電點(diǎn)為9.05,總原子數(shù)為5855,存在信號(hào)肽,屬于分泌型蛋白,二級(jí)結(jié)構(gòu)具有0α螺旋(Hh)38.54%,延伸鏈(Ee)19.53%,β折疊(Tt)8.33%,無(wú)規(guī)則卷曲(Cc)33.59%;此酶以2r11.1.A(有機(jī)磷水解酶)序列為模板一致性達(dá)99.39%,覆蓋度86%,OPD蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)含有2個(gè)銅原子,該酶將為今后基因工程菌的構(gòu)建提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱商業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：X172;X592;TQ925

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2798944