本文關(guān)鍵詞：重組瓊膠酶AgaD的高效表達及初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：瓊膠來源于紫菜、石花菜等紅藻細胞壁,主要成分為硫瓊膠和瓊脂糖,瓊脂糖由β-D-呋喃半乳糖和3.6-內(nèi)醚-α-L-呋喃半乳糖通過β-1,4-糖苷鍵和α-1,3-糖苷鍵交替連接而成。瓊膠酶是降解瓊脂糖產(chǎn)生瓊膠寡糖的一類糖苷水解酶,根據(jù)其降解瓊脂糖的方式可以分為α-瓊膠酶和β-瓊膠酶。目前已經(jīng)報道的瓊膠酶多為β-瓊膠酶,分屬于糖苷水解酶GH-16、50、86和118家族,而α-瓊膠酶數(shù)量非常少,僅有4個,均屬于GH-96家族。β-瓊膠酶降解瓊脂糖的β-1,4糖苷鍵產(chǎn)生新瓊寡糖,α-瓊膠降解α-1,3糖苷鍵產(chǎn)生瓊寡糖。瓊膠寡糖屬于中性糖,具有多種生物學活性,是一種潛在的益生元寡糖。課題組前期從青島海域分離得到一株產(chǎn)瓊膠酶的菌株Thalassomonas sp.LD5,通過構(gòu)建野生菌株的基因組文庫結(jié)合兼并PCR和site-finding PCR的方法獲得了瓊膠酶編碼基因agaD,其開放閱讀框長4401bp,編碼1466個氨基酸。序列分析表明,AgaD與GH-96家族已有文獻報道的兩個α-瓊膠酶成員的氨基酸序列相似性分別達到了77%和89%。對AgaD野生酶和初步表達的重組酶研究發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)量均非常低(重組酶僅有20U/L),因此提高重組酶AgaD的產(chǎn)量對后續(xù)研究非常必要。本研究首先探討了密碼子適用性對agaD重組表達的影響,通過基因合成的方法合成了優(yōu)化后的基因optagaD;選擇了三種不同的E.coli表達宿主,結(jié)果表明,目的基因在AD494(DE3)宿主中表達的酶活最高,達到450U/L發(fā)酵液,表明二硫鍵的形成可能對酶的正確折疊具有重要的作用；根據(jù)N端法則,研究了N端第二個氨基酸替換后對重組酶的影響,結(jié)果表明將苯丙氨酸(Phe)替換為丙氨酸(Ala)后,胞外酶產(chǎn)量提高了近5倍,并且重組酶的發(fā)酵時間縮短了一半；最后,探究了不同的發(fā)酵條件及培養(yǎng)基添加成分對產(chǎn)酶量的影響,確定了500 mL瓶中的最適裝樣量為50 mL,最適誘導劑濃度為0.0004mol/L,誘導溫度為25℃,添加CaC12至濃度0.005-0.02 mol/L、甘氨酸(Gly)至濃度0.1mol/L均可以明顯提高胞外酶的產(chǎn)量。最終經(jīng)過表達宿主、N端法則、發(fā)酵條件、培養(yǎng)基等優(yōu)化,發(fā)酵液上清中重組瓊膠酶AgaD的產(chǎn)量由20U/L提高到了11300 U/L,提高了近500倍,為瓊膠酶AgaD的深入研究奠定了基礎(chǔ)。接下來我們探討了重組酶的分離純化條件,重組酶可以被60%飽和度的硫酸銨沉淀,但是硫酸銨對酶活有明顯的抑制作用,不利于后期的分離純化檢測,NaCl替代實驗發(fā)現(xiàn)盡管菌株LD5分離自海洋細菌,但是重組瓊膠酶AgaD表現(xiàn)出非常強的NaCl抑制性,當濃度達到2mol/L時,活力下降了一半以上。相反,CaCl2可以明顯促進酶的活力,在0.05 mol/L CaCl2存在時即使NaCl濃度達到4mol/L酶活力仍然可以維持穩(wěn)定在原來的90%以上；構(gòu)建了攜帶Flag標簽的重組蛋白,分別利用His標簽抗體及Flag標簽抗體對純化的蛋白進行了Western-blot檢測,結(jié)果表明兩種抗體檢測均出現(xiàn)多個條帶,該結(jié)果與凝膠原位復性方法檢測結(jié)果一致,進一步表明目的蛋白發(fā)生了不同程度的剪切或斷裂,導致純化的蛋白在SDS-PAGE上呈現(xiàn)出不同大小的片段。利用純化后的重組蛋白研究了AgaD降解瓊脂糖的終產(chǎn)物,薄層層析及熒光輔助電泳顯示終產(chǎn)物的遷移率與瓊?cè)窍嗨�；使用用不同聚合度的新瓊寡糖作為底物分析了AgaD的催化腔特征,結(jié)果表明AgaD不能降解新瓊二糖和四糖,對新瓊六糖僅能部分降解,而新瓊八糖和十糖可以完全降解,因此我們認為該酶的催化腔最小可以容納六個糖單元；AgaD降解瓊脂糖的降解曲線表明,該酶降解瓊脂糖的方式為內(nèi)切。在后續(xù)研究中我們將進一步對重組蛋白AgaD的剪切或斷裂機制進行研究。此外,我們在分離純化重組酶中發(fā)現(xiàn)選用的幾種宿主菌均能夠表達β-半乳糖苷酶和α-半乳糖苷酶,而這些酶在分離純化過程中不容易去除,導致AgaD的降解產(chǎn)物可能進一步發(fā)生降解,因此無法利用產(chǎn)物的還原端正確判定AgaD的屬性,因此我們將通過更換宿主菌或者基因敲除的方式,以及其他的分離純化手段獲得不含有半乳糖苷酶的重組蛋白,并利用核磁、質(zhì)譜等方法研究AgaD產(chǎn)物的屬性。
【關(guān)鍵詞】：瓊膠酶 重組表達 分離純化 降解方式
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;Q55
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-15
• 0 前言15-28
• 0.1 瓊膠(agar)及瓊寡糖15-16
• 0.2 瓊膠酶16-25
• 0.2.1 瓊膠酶分類16-18
• 0.2.2 瓊膠酶來源及性質(zhì)18-20
• 0.2.3 瓊膠酶的基因克隆及重組表達20-22
• 0.2.4 瓊膠酶的晶體結(jié)構(gòu)研究22-24
• 0.2.5 瓊膠酶的應用24-25
• 0.3 前期工作及展望25-28
• 1 agaD序列密碼子優(yōu)化及不同表達宿主的表達28-41
• 1.1 實驗材料與儀器28-29
• 1.1.1 實驗儀器28-29
• 1.1.2 實驗試劑和材料29
• 1.2 實驗方法29-33
• 1.2.1 agaD序列分析及密碼子優(yōu)化29-30
• 1.2.2 優(yōu)化后目的基因的獲得30-31
• 1.2.3 制備pET-22b(+)載體31
• 1.2.4 構(gòu)建重組表達體系31-32
• 1.2.5 optagaD基因的誘導表達32
• 1.2.6 酶活的測定32-33
• 1.2.7 常規(guī)最適表達條件的確定33
• 1.3 實驗結(jié)果33-39
• 1.3.1 優(yōu)化目的基因33-34
• 1.3.2 獲得優(yōu)化后的目的片段optagaD34
• 1.3.3 pET-22b(+)載體制備34-35
• 1.3.4 連接后的酶切鑒定35
• 1.3.5 DNS法測定酶活所使用的D-半乳糖標準曲線35-36
• 1.3.6 轉(zhuǎn)化不同宿主發(fā)酵上清的酶活力測定36-37
• 1.3.7 最適表達條件的確定37-39
• 1.4 小結(jié)及討論39-41
• 2 N端第2個氨基酸突變體構(gòu)建41-49
• 2.1 實驗儀器與材料41-42
• 2.1.1 實驗儀器41-42
• 2.1.2 實驗試劑和材料42
• 2.2 實驗方法42-46
• 2.2.1 將目的基因N端突變42-44
• 2.2.2 制備pET-22b(+)載體44-45
• 2.2.3 建立重組表達系統(tǒng)45
• 2.2.4 optagaDx基因的表達45-46
• 2.3 實驗結(jié)果46-47
• 2.3.1 突變后基因的獲取46
• 2.3.2 制備pET-22b(+)載體46
• 2.3.4 酶切鑒定連接后產(chǎn)物46-47
• 2.3.5 突變前后產(chǎn)酶情況比較47
• 2.4 小結(jié)及討論47-49
• 3 搖瓶培養(yǎng)初步優(yōu)化49-56
• 3.1 實驗儀器與材料49-50
• 3.1.1 實驗儀器49
• 3.1.2 實驗材料49-50
• 3.2 實驗方法50-51
• 3.2.1 種子培養(yǎng)液的培養(yǎng)50
• 3.2.2 不同的裝樣量50
• 3.2.3 在培養(yǎng)基中添加不同碳源或消泡劑50
• 3.2.4 在培養(yǎng)基中添加CaCl_250
• 3.2.5 在培養(yǎng)基中添加Gly50-51
• 3.2.6 常規(guī)最適表達條件的確定51
• 3.2.7 酶活測定方法51
• 3.3 實驗結(jié)果51-54
• 3.3.1 不同裝樣量對酶活的影響51
• 3.3.2 在培養(yǎng)基中添加不同碳源或消泡劑51-52
• 3.3.3 在培養(yǎng)基中添加CaCl_252-53
• 3.3.4 在培養(yǎng)基中添加Gly53-54
• 3.3.5 常規(guī)最適表達條件的確定54
• 3.4 小結(jié)及討論54-56
• 4 重組瓊膠酶AgaD的純化及檢測56-75
• 4.1 實驗儀器與材料56-57
• 4.1.1 實驗儀器56-57
• 4.1.2 實驗試劑57
• 4.2 實驗方法57-64
• 4.2.1 AgaD瓊膠酶的發(fā)酵57
• 4.2.2 NaCl及CaCl_2對酶活的影響57-58
• 4.2.3 硫酸銨沉淀發(fā)酵液58-59
• 4.2.4 離子交換層析59
• 4.2.5 鎳離子層析59
• 4.2.6 疏水作用層析59-60
• 4.2.7 酶活測定方法60
• 4.2.8 蛋白質(zhì)濃度及比活力測定60
• 4.2.9 蛋白電泳檢測60
• 4.2.10 His抗體檢測目的蛋白60-61
• 4.2.11 構(gòu)建Ecoli AD494(DE3)-pET-22b(+)-optagaDx-Flag表達體系61-64
• 4.2.12 optagaDx-Flag基因的表達及Western-blot檢測64
• 4.2.13 膠復性檢測目的蛋白64
• 4.3 實驗結(jié)果64-74
• 4.3.1 硫酸銨沉淀64-65
• 4.3.2 NaCl及CaCl_2對酶活的影響65-66
• 4.3.3 離子交換層析66-67
• 4.3.4 鎳離子柱層析67-68
• 4.3.5 疏水作用層析68-69
• 4.3.6 蛋白含量的測定69-70
• 4.3.7 蛋白電泳檢測70-71
• 4.3.8 His抗體檢測目的蛋白71-72
• 4.3.9 構(gòu)建Ecoli AD494(DE3)-pET-22b(+)-optagaDx-Flag表達體系72
• 4.3.10 optagaDx-Flag基因的表達及Western-blot檢測72-73
• 4.3.11 膠復性檢測目的蛋白73-74
• 4.4 小結(jié)及討論74-75
• 5 AgaD重組瓊膠酶初步研究75-85
• 5.1 實驗儀器與材料75-76
• 5.1.1 實驗儀器75-76
• 5.1.2 實驗材料76
• 5.2 實驗方法76-78
• 5.2.1 獲得瓊膠寡糖標準品76
• 5.2.2 獲得AgaD降解產(chǎn)物76
• 5.2.3 TLC層析鑒定寡糖76-77
• 5.2.4 AgaD降解不同的寡糖77
• 5.2.5 AgaD不同時間降解產(chǎn)物77
• 5.2.6 熒光輔助碳水化合物電泳(FACE)檢測降解情況77-78
• 5.3 實驗結(jié)果78-84
• 5.3.1 新瓊寡糖的制備及定量結(jié)果78-79
• 5.3.2 AgaD降解瓊脂糖酶的補加策略79-80
• 5.3.3 AgaD降解瓊脂糖的終產(chǎn)物分析80-81
• 5.3.4 AgaD最小底物確定81-82
• 5.3.5 AgaD降解瓊脂糖的Time course曲線82-84
• 5.4 小結(jié)與討論84-85
• 總結(jié)及展望85-86
• 參考文獻86-91
• 附錄91-103
• 附錄1 培養(yǎng)基、試劑及溶液的配制91-96
• 附錄2 常用分子生物學實驗方法96-101
• 附錄3 縮略詞101-103
• 致謝103-104
• 個人簡歷、在學期間發(fā)表的學術(shù)論文與研究成果104

【相似文獻】

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉歡;重組瓊膠酶AgaD的高效表達及初步研究[D];中國海洋大學;2015年

  本文關(guān)鍵詞：重組瓊膠酶AgaD的高效表達及初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：269422