【摘要】：酯酶普遍存在于動植物和微生物中,能夠催化酯鍵水解,并參與酯化、轉(zhuǎn)酯、酯交換等多種反應(yīng)。微生物來源的酯酶作為一類重要的工業(yè)酶制劑,由于其反應(yīng)條件穩(wěn)定、催化活性高和產(chǎn)物易分離等優(yōu)點,廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥化工生產(chǎn)、污水凈化和能源利用等領(lǐng)域,成為目前應(yīng)用酶學(xué)方面研究的熱點。本論文主要針對一個篩選自赤桿菌科細菌基因組的酯酶,開展誘導(dǎo)表達、分離純化、酶學(xué)性質(zhì)和晶體結(jié)構(gòu)解析研究,為進一步研究酯酶的催化機制和結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供理論支持。本文研究中,首先針對篩選自赤桿菌科細菌Erythrobacter longus基因組的酯酶E53開展誘導(dǎo)表達、蛋白純化和酶學(xué)性質(zhì)研究。結(jié)果表明酯酶E53分子量大小為33.13 kDa,最適催化底物為對硝基苯酚丁酸酯,最適反應(yīng)條件為pH 9.0,溫度40°C。酯酶E53對于金屬離子Mn~(2+)、Mg~(2+)、Ca~(2+)和Ba~(2+)以及異丙醇、乙醇、甲醇等有機溶劑具有良好的耐受性,具有潛在的應(yīng)用前景。其次,通過表達純化獲得酯酶E53蛋白,并針對蛋白結(jié)晶條件開展優(yōu)化,最終篩選獲得形狀規(guī)則、晶型較好的單晶。收集晶體X射線衍射數(shù)據(jù),并對晶體結(jié)構(gòu)進行解析和修正,獲得酯酶E53接近完整的三維結(jié)構(gòu),為進一步研究酯酶E53的催化機制奠定了基礎(chǔ)。最后,通過定點突變構(gòu)建了酯酶E53的12個突變體,并對酯酶突變體開展酶學(xué)性質(zhì)研究。結(jié)果表明,酯酶突變體E53-D161A、E53-S285G和E53-N288A的酶活力和催化反應(yīng)速率是野生型酯酶的1%-20%左右,以上三個位點的氨基酸在酯酶的催化反應(yīng)發(fā)揮重要作用;酯酶突變體E53-A167L、E53-F191Y、E53-V211A和E53-S216A酶活力和催化反應(yīng)速率與野生型酯酶相比增加了50%以上,表明以上四個位點氨基酸對酯酶催化反應(yīng)有一定的影響;催化活性位點的酯酶突變體E53-S162A、E53-D254A和E53-H284A酶活力只有野生型的萬分之一左右,表明活性位點對于酯酶的催化反應(yīng)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。綜上所述,通過對酯酶E53酶學(xué)性質(zhì)的研究,結(jié)果表明其具有潛在的應(yīng)用價值;對酯酶E53的晶體結(jié)構(gòu)解析為進一步研究酯酶的催化機制和結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系奠定了良好的基礎(chǔ);酯酶E53突變體構(gòu)建及其酶學(xué)性質(zhì)的研究,為探索與酯酶的催化反應(yīng)發(fā)揮重要作用的氨基酸殘基和進一步構(gòu)建適合工業(yè)應(yīng)用的工程酶奠定了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q55

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 張敏文;劉悅;李荷;;微生物酯酶的研究進展[J];廣東第二師范學(xué)院學(xué)報;2012年03期

2 許學(xué)勤,徐斐,吳燕雯,吳瑛,華澤釗;固定化對動植物酯酶性質(zhì)的影響[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2004年07期

3 施安輝,周波;酯酶的微生物類群、酯化特性及其應(yīng)用前景[J];中國釀造;2002年06期

4 彭立鳳,趙汝淇,譚天偉;微生物脂肪酶的應(yīng)用[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2000年03期

5 鄔敏辰,孫崇榮,鄔顯章;平板擴散法粗略確定堿性脂肪酶的活性[J];無錫輕工大學(xué)學(xué)報;2000年02期

6 宋欣,曲音波,葉寒青,胡曉燕;具脂肪酶和酯酶活性酵母菌的選育和酶學(xué)性質(zhì)初步研究[J];應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報;1999年06期

7 王美英;徐家立;;白地霉一新變種的鑒定及其脂肪酶的研究[J];微生物學(xué)報;1989年01期

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本文編號：2585771