【摘要】：酯酶普遍存在于動植物和微生物中,能夠催化酯鍵水解,并參與酯化、轉酯、酯交換等多種反應。微生物來源的酯酶作為一類重要的工業(yè)酶制劑,由于其反應條件穩(wěn)定、催化活性高和產(chǎn)物易分離等優(yōu)點,廣泛應用于食品加工、醫(yī)藥化工生產(chǎn)、污水凈化和能源利用等領域,成為目前應用酶學方面研究的熱點。本論文主要針對一個篩選自赤桿菌科細菌基因組的酯酶,開展誘導表達、分離純化、酶學性質和晶體結構解析研究,為進一步研究酯酶的催化機制和結構與功能關系提供理論支持。本文研究中,首先針對篩選自赤桿菌科細菌Erythrobacter longus基因組的酯酶E53開展誘導表達、蛋白純化和酶學性質研究。結果表明酯酶E53分子量大小為33.13 kDa,最適催化底物為對硝基苯酚丁酸酯,最適反應條件為pH 9.0,溫度40°C。酯酶E53對于金屬離子Mn~(2+)、Mg~(2+)、Ca~(2+)和Ba~(2+)以及異丙醇、乙醇、甲醇等有機溶劑具有良好的耐受性,具有潛在的應用前景。其次,通過表達純化獲得酯酶E53蛋白,并針對蛋白結晶條件開展優(yōu)化,最終篩選獲得形狀規(guī)則、晶型較好的單晶。收集晶體X射線衍射數(shù)據(jù),并對晶體結構進行解析和修正,獲得酯酶E53接近完整的三維結構,為進一步研究酯酶E53的催化機制奠定了基礎。最后,通過定點突變構建了酯酶E53的12個突變體,并對酯酶突變體開展酶學性質研究。結果表明,酯酶突變體E53-D161A、E53-S285G和E53-N288A的酶活力和催化反應速率是野生型酯酶的1%-20%左右,以上三個位點的氨基酸在酯酶的催化反應發(fā)揮重要作用;酯酶突變體E53-A167L、E53-F191Y、E53-V211A和E53-S216A酶活力和催化反應速率與野生型酯酶相比增加了50%以上,表明以上四個位點氨基酸對酯酶催化反應有一定的影響;催化活性位點的酯酶突變體E53-S162A、E53-D254A和E53-H284A酶活力只有野生型的萬分之一左右,表明活性位點對于酯酶的催化反應發(fā)揮著關鍵作用。綜上所述,通過對酯酶E53酶學性質的研究,結果表明其具有潛在的應用價值;對酯酶E53的晶體結構解析為進一步研究酯酶的催化機制和結構與功能關系奠定了良好的基礎;酯酶E53突變體構建及其酶學性質的研究,為探索與酯酶的催化反應發(fā)揮重要作用的氨基酸殘基和進一步構建適合工業(yè)應用的工程酶奠定了理論基礎。
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q55

【參考文獻】

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本文編號：2585771