【摘要】：作為粘細菌的模式菌,黃色粘球菌具備多細胞水平的典型社會性特征,能夠進行復雜多樣化的細胞行為并貫穿于其生命周期的各個環(huán)節(jié),主要包括:在固體介質表面進行的群體細胞運動過程;群體細胞的捕食過程;子實體的發(fā)育。其中社會性細胞運動(S運動)是黃色粘球菌進行捕食和分化發(fā)育的行為基礎,其分子機制的解析對黃色粘球菌多細胞水平的社會性行為研究具有重要的理論指導意義。S運動系統(tǒng)主要介導了黃色粘球菌細胞在固體表面的群體運動過程,與銅綠假單胞菌的顫動系統(tǒng)非常類似,胞外多糖(EPS)和Ⅳ型菌毛(TFP)參與的收縮模型是目前普遍接受的S運動分子機制。EPS為TFP的收縮提供了錨定的位點;細胞前導端伸出的TFP細絲抓住附近細胞產生的EPS并激發(fā)收縮,從而拉動細胞以粘-滑交替的方式前行。在這一過程中,TFP與EPS這兩個胞外生物大分子之間的特異性相互作用的實質是極為重要的科學問題。在本學位論文中,我們對組成TFP的菌毛蛋白PilA與EPS在互作過程中各自參與識別的關鍵位點進行了探尋。首先,我們利用表面等離子共振的方法,基于直接偶聯(lián)、多循環(huán)動力學-捕獲、單循環(huán)動力學-捕獲以及多循環(huán)動力學競爭等手段構建了 PilA-糖類生物大分子體外相互作用的檢測體系。首先分析了 EPS天然類似物殼聚糖與PilA蛋白的相互作用。結果顯示,不同分子量的殼聚糖均可以通過直接偶聯(lián)的方式與PilA蛋白相互作用。隨后,根據(jù)提取方法的不同,我們從黃色粘球菌DK1622菌株中獲取了可溶性與不可溶性的EPS,在直接偶聯(lián)模式下,無論是可溶性還是不可溶性的EPS均與PilA蛋白存在相互作用。直接偶聯(lián)法由于偶聯(lián)的方式簡單被廣泛應用,但是該方法也存在特異性吸附以及蛋白偶聯(lián)方向不一致導致蛋白結合位點被屏蔽等弊端。因此,我們改進了檢測手段,建立了多循環(huán)動力學-捕獲法以及單循環(huán)動力學-捕獲法,EPS與PilA蛋白相互作用的陽性信號響應值明顯增大。既然EPS與PilA蛋白間存在相互作用,那么EPS參與識別PilA蛋白的關鍵位點是什么?我們分別檢測了參與構成EPS的各個單糖組分與PilA蛋白之間的結合能力。結果顯示,含有氨基的單糖能夠與PilA蛋白結合,而無修飾的單糖以及N-乙酰修飾的氨基單糖均不能與PilA蛋白結合。該結果與等溫滴定量熱儀測定的結果一致。同時,基于多循環(huán)動力學-捕獲法的競爭實驗結果顯示葡萄糖胺能夠與EPS競爭性結合PilA蛋白。另一方面,我們對PilA蛋白參與識別EPS的關鍵位點也進行了分析。根據(jù)生物信息學分析的結果,我們推測PilA蛋白中有22個氨基酸殘基位點可能參與了 EPS的識別。從中選取了 3個位點,即Tyr69、Trp146、Trp181,分別將其突變成為Ala。體外互作的結果顯示,PilA(W146A、W181A)突變型蛋白和EPS的相互作用與野生型蛋白無差別,而PilA(Y69A)突變型蛋白與氨基糖類的相互作用消失,推測Tyr69可能是PilA蛋白與EPS互作識別時的關鍵位點。隨后,將含有突變位點的全長PilA基因回補到PilA蛋白缺失菌株10410中,結果顯示菌株 DK10410::PilAY69A,DK10410::PilAw146A和 DK10410::Pi1Aw181A在固體平板上的S運動能力喪失。在甲基纖維素實驗中,菌株DK10410::PilAY69A和DK10410::PilAW146A呈現(xiàn)出一定程度的運動趨勢,而菌株DK10410::PilAw181A沒有明顯運動趨勢。Western Blot分析顯示,三種回補菌株均沒有表面菌毛,菌株菌株DK10410::PilAY69A和DK10410::PilAw146A具有全細胞菌毛蛋白。根據(jù)以上實驗結果,我們認為Trp146突變后能夠產生PilA蛋白,但是PilA蛋白不能進行有效組裝,而Trp181突變后不產生任何的PilA蛋白。Tyr69突變后能夠產生少量的PilA蛋白,但是PilA蛋白不能進行有效組裝。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q936
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本文編號：2573221