【摘要】：糖類(包括單糖,寡糖和多糖)及糖綴合物在很多關鍵復雜的生命活動中發(fā)揮著非常重要的作用,是生物體中是不可缺少的。脂多糖由類脂A(內(nèi)毒素)、核心多糖和O抗原(OPS)構成,是革蘭氏陰性菌細胞外特有的組成成分。O抗原位于細菌表面,通常以O抗原糖鏈的長短,將O抗原劃分為三種類型:long型、intermediate 型和 short 型。我們課題組已將細菌N-糖基化系統(tǒng)與大腸桿菌的O抗原合成過程相結合,在細菌體內(nèi)生成糖-蛋白綴合物疫苗,對純化的蛋白進行了 Western blot驗證及MALDI-TOF-MS 驗證。近年來,研究發(fā)現(xiàn)一種新的糖基轉移酶HMW1C,HMW1C是一種細胞質(zhì)中的N-糖基轉移酶,可以直接利用細胞質(zhì)中游離的UDP-Glc或UDP-Gal,將其直接轉移至多肽的天冬酰胺殘基上,這是與傳統(tǒng)的N-糖基轉移酶PglB明顯不同的,被稱為新的N-糖基轉移酶。由于HMW1C的晶體結構不容易得到,所以目前研究最透徹的是與其在氨基酸序列上高度同源的糖基轉移酶ApNGT,來源于胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropnemoniae)。ApNGT屬于GT41糖基轉移酶蛋白家族,其包含三個不同的結構域,N末端的α螺旋AAD結構域和C末端由兩個Rossman-like形成的GT-B折疊結構域,以及AAD與GT-B之間形成的凹槽。本論文的第二章是選取了兩個氨基酸序列上與ApNGT同源性較高的,分別來源于嗜沫嗜血桿菌(Aggregatibacteraphrophilus)和海藻糖巴氏桿菌(Bibersteinia trehalosi)的N-糖基轉移酶AaNGT和BtNGT。對其基本的酶學性質(zhì)進行研究,包括最適溫度,pH和金屬離子對其活性的影響。還選取了一些UDP糖衍生物,研究AaNGT,BtNGT和ApNGT的糖基供體底物特異性。我們發(fā)現(xiàn)AaNGT利用UDP-Glc的效率是最高的,并且AaNGT可以利用特殊的UDP-Sugar衍生物 UDP-GlcNH2。文中的第三章是利用生物發(fā)酵一步生產(chǎn)糖蛋白,主要是利用改造菌株E.coli W3110 △waal pBAD24-mbp pACT3-pglb,E.coli W3110 的 O抗原僅由一個GlcNAc組成,在敲除O抗原連接酶waal基因之后,利用PglB理論上可以將周質(zhì)空間中游離的脂載體的GlcNAc轉移至載體蛋白MBP上,形成MBP-GlcNAc。我們對發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白進行糖基化的驗證。利用這個平臺我們可以在體外利用不同的糖基轉移酶對糖鏈進行修飾,得到各種各樣糖鏈的糖蛋白,這將為糖蛋白的發(fā)展產(chǎn)生深遠的影響。本文章的第四章主要是關于用wzz基因調(diào)控糖鏈長度的探索,我們選取不同的 wzz 基因:E.coli O86:B7 wzz(short 型),E.coli O157:H7 wzz(intermediate 型)和E.coli O127 wzz(long型)。利用ccdB毒蛋白反向篩選和體外同源重組的技術將三種不同來源的wzz插入質(zhì)粒中。接著構建表達菌株E.coli W3110 △waal pYES1L-O157 rfb pBAD24-mbp-pglb,發(fā)酵產(chǎn)生糖蛋白并對其糖鏈的長短進行鑒定。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q55

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本文編號：2528513