【摘要】：糖類(包括單糖,寡糖和多糖)及糖綴合物在很多關(guān)鍵復(fù)雜的生命活動(dòng)中發(fā)揮著非常重要的作用,是生物體中是不可缺少的。脂多糖由類脂A(內(nèi)毒素)、核心多糖和O抗原(OPS)構(gòu)成,是革蘭氏陰性菌細(xì)胞外特有的組成成分。O抗原位于細(xì)菌表面,通常以O(shè)抗原糖鏈的長(zhǎng)短,將O抗原劃分為三種類型:long型、intermediate 型和 short 型。我們課題組已將細(xì)菌N-糖基化系統(tǒng)與大腸桿菌的O抗原合成過程相結(jié)合,在細(xì)菌體內(nèi)生成糖-蛋白綴合物疫苗,對(duì)純化的蛋白進(jìn)行了 Western blot驗(yàn)證及MALDI-TOF-MS 驗(yàn)證。近年來,研究發(fā)現(xiàn)一種新的糖基轉(zhuǎn)移酶HMW1C,HMW1C是一種細(xì)胞質(zhì)中的N-糖基轉(zhuǎn)移酶,可以直接利用細(xì)胞質(zhì)中游離的UDP-Glc或UDP-Gal,將其直接轉(zhuǎn)移至多肽的天冬酰胺殘基上,這是與傳統(tǒng)的N-糖基轉(zhuǎn)移酶PglB明顯不同的,被稱為新的N-糖基轉(zhuǎn)移酶。由于HMW1C的晶體結(jié)構(gòu)不容易得到,所以目前研究最透徹的是與其在氨基酸序列上高度同源的糖基轉(zhuǎn)移酶ApNGT,來源于胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropnemoniae)。ApNGT屬于GT41糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白家族,其包含三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域,N末端的α螺旋AAD結(jié)構(gòu)域和C末端由兩個(gè)Rossman-like形成的GT-B折疊結(jié)構(gòu)域,以及AAD與GT-B之間形成的凹槽。本論文的第二章是選取了兩個(gè)氨基酸序列上與ApNGT同源性較高的,分別來源于嗜沫嗜血桿菌(Aggregatibacteraphrophilus)和海藻糖巴氏桿菌(Bibersteinia trehalosi)的N-糖基轉(zhuǎn)移酶AaNGT和BtNGT。對(duì)其基本的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,包括最適溫度,pH和金屬離子對(duì)其活性的影響。還選取了一些UDP糖衍生物,研究AaNGT,BtNGT和ApNGT的糖基供體底物特異性。我們發(fā)現(xiàn)AaNGT利用UDP-Glc的效率是最高的,并且AaNGT可以利用特殊的UDP-Sugar衍生物 UDP-GlcNH2。文中的第三章是利用生物發(fā)酵一步生產(chǎn)糖蛋白,主要是利用改造菌株E.coli W3110 △waal pBAD24-mbp pACT3-pglb,E.coli W3110 的 O抗原僅由一個(gè)GlcNAc組成,在敲除O抗原連接酶waal基因之后,利用PglB理論上可以將周質(zhì)空間中游離的脂載體的GlcNAc轉(zhuǎn)移至載體蛋白MBP上,形成MBP-GlcNAc。我們對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白進(jìn)行糖基化的驗(yàn)證。利用這個(gè)平臺(tái)我們可以在體外利用不同的糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)糖鏈進(jìn)行修飾,得到各種各樣糖鏈的糖蛋白,這將為糖蛋白的發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。本文章的第四章主要是關(guān)于用wzz基因調(diào)控糖鏈長(zhǎng)度的探索,我們選取不同的 wzz 基因:E.coli O86:B7 wzz(short 型),E.coli O157:H7 wzz(intermediate 型)和E.coli O127 wzz(long型)。利用ccdB毒蛋白反向篩選和體外同源重組的技術(shù)將三種不同來源的wzz插入質(zhì)粒中。接著構(gòu)建表達(dá)菌株E.coli W3110 △waal pYES1L-O157 rfb pBAD24-mbp-pglb,發(fā)酵產(chǎn)生糖蛋白并對(duì)其糖鏈的長(zhǎng)短進(jìn)行鑒定。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q55

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本文編號(hào)：2528513