【摘要】：細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位,通過顯微成像觀測細(xì)胞內(nèi)部不同物質(zhì)和成分的空間分布及相互作用,是目前生物學(xué)研究的一個(gè)重要手段。顯微成像具有無損、非接觸、高特異性和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn),但由于光學(xué)衍射極限的限制,傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率只能達(dá)到200nm左右。這大大限制了人們對于納米級(jí)別生物分子的構(gòu)成及其功能的觀測和研究。近年來,隨著科技的發(fā)展科學(xué)家們發(fā)明了多種突破光學(xué)衍射極限的超分辨成像技術(shù),且成像分辨率可達(dá)到10-50nm(接近電鏡的分辨率)。目前,基于遠(yuǎn)場光學(xué)的超分辨成像技術(shù)主要有兩大類:一類是利用非線性光學(xué)的方法實(shí)現(xiàn)超分辨成像,如受激發(fā)射損耗(STED)熒光顯微技術(shù)和飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)(SSIM);另一類是利用單分子定位的方法實(shí)現(xiàn)超分辨成像,如光激活定位顯微技術(shù)(PALM)和隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)(STORM)。由于超分辨成像技術(shù)可被應(yīng)用在生物科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域,如觀測細(xì)胞膜的蛋白分布、微絲、微管、線粒體、核纖層等生物樣品,因此超分辨熒光顯微技術(shù)成為近幾年的研究熱點(diǎn)之一,且得到了快速的發(fā)展。對細(xì)胞骨架的研究在生物學(xué)上有著重大的意義,但是細(xì)胞骨架的直徑大小一般約為幾十個(gè)納米,用常規(guī)的共聚焦顯微鏡很難觀察到,因此本論文提出利用STORM超分辨成像技術(shù)研究細(xì)胞骨架。在本論文中我們主要進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)樣品的抗體濃度、孵育條件的優(yōu)化,包括一抗孵育條件和不同抗體濃度的實(shí)驗(yàn);以及五組不同激發(fā)光功率的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,一抗過夜孵育能讓抗體充分標(biāo)記上微管,從而得到更為連貫的絲狀結(jié)構(gòu),不同抗體濃度孵育對樣品成像結(jié)果影響不大,表明在測試的抗體濃度下,標(biāo)記的樣品已達(dá)到過飽和狀態(tài),再作微調(diào)對成像效果產(chǎn)生影響不大;激發(fā)光功率在20.0mW左右得到的重構(gòu)結(jié)果最佳,表明在激發(fā)光功率為20.0mW時(shí),分子單次閃爍產(chǎn)生的總光子數(shù)較多且閃爍效果更為理想,從而得到更連續(xù)的細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)。氧氣參與細(xì)胞內(nèi)部循環(huán),能產(chǎn)生供給細(xì)胞生長、增殖和合成所需的能量。因此氧氣是保證細(xì)胞得以正常生長的必需氣體環(huán)境之一。缺氧會(huì)導(dǎo)致組織代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化,缺氧性細(xì)胞損傷主要為細(xì)胞膜、線粒體和溶酶體的損傷。很多腫瘤組織微環(huán)境處于缺氧狀態(tài),缺氧與腫瘤細(xì)胞的生理功能關(guān)系密切。利用優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),對缺氧處理后的HeLa細(xì)胞的微管結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)記染色,然后進(jìn)行STORM超分辨成像,將正常培養(yǎng)的微管超分辨成像圖與進(jìn)行缺氧處理后的微管超分辨成像圖進(jìn)行對比。結(jié)果表明,缺氧環(huán)境下的HeLa細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)變得更為交錯(cuò)雜亂且十分密集,這種情況也會(huì)出現(xiàn)在細(xì)胞分裂期階段。這與2017年Ji?í?ehulka課題組對腫瘤細(xì)胞缺氧進(jìn)行研究[47]的報(bào)道結(jié)果一致:細(xì)胞由某種未知途徑進(jìn)入到細(xì)胞分裂階段,引起腫瘤細(xì)胞的大范圍遷移擴(kuò)散的原因或結(jié)果,從而增強(qiáng)其抗藥性和耐藥性。
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【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q245

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2435952