【摘要】：宿主限制因子是宿主體內(nèi)表達(dá)的,能夠?qū)共《靖腥镜牡鞍�。參與抑制人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)的宿主限制因子包括APOBEC3、Trim5α、BST-2和SAMHD1等。SAMHD1作為宿主限制因子于2011年由Laguette等人發(fā)現(xiàn),它是一個(gè)由SAM結(jié)構(gòu)域和HD結(jié)構(gòu)域組成的核定位蛋白。其中HD結(jié)構(gòu)域具有d NTP水解酶(d NTPase)活性,能夠?qū)⒓?xì)胞中的d NTP代謝成為脫氧核糖核苷以及游離的三磷酸基團(tuán)。SAMHD1的d NTPase活性能夠調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的d NTP含量,從而抑制HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄過程,發(fā)揮其抗病毒功能。然而,HIV-2和猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus,SIV)表達(dá)的Vpx蛋白能夠降解SAMHD1,從而使病毒恢復(fù)復(fù)制進(jìn)程。研究表明當(dāng)刪除SAMHD1的核定位信號(hào)(nuclear location signal,NLS)后,SAMHD1會(huì)重新定位至細(xì)胞質(zhì)中,且能夠拮抗Vpx的降解,同時(shí)增強(qiáng)其抗病毒能力,這說明SAMHD1的核定位信號(hào)能夠影響其抗病毒作用。另外,對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物SAMHD1與Vpx的相互作用研究發(fā)現(xiàn),SAMHD1在一些氨基酸位點(diǎn)的改變會(huì)影響Vpx引發(fā)的降解作用,而對(duì)于與人類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的非靈長(zhǎng)類,則可能存在更多影響SAMHD1與Vpx相互作用的因素。目前對(duì)于其它物種SAMHD1的結(jié)構(gòu)和功能研究鮮有描述,因此,本論文選擇常被當(dāng)作HIV模式生物的貓以及本實(shí)驗(yàn)組在APOBEC3G(A3G)與Vif相互作用研究中發(fā)現(xiàn)與人源A3G-Vif有著不同結(jié)合模式的牛作為研究對(duì)象,探究不同種屬SAMHD1的核定位信號(hào)對(duì)其抗病毒能力的影響機(jī)制。旨在進(jìn)一步了解Vpx與SAMHD1的相互作用模式以及SAMHD1的抗病毒機(jī)制。在本研究中,我們首先分析了人源(homo)、貓?jiān)?feline)以及牛源(bovine)SAMHD1的氨基酸序列,序列比對(duì)結(jié)果表明SAMHD1的核定位信號(hào)在人、貓和牛之間具有保守性。細(xì)胞定位結(jié)果顯示三個(gè)種屬的SAMHD1蛋白在核定位信號(hào)缺失后均重定位至細(xì)胞質(zhì)中。在隨后的抗病毒感染實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn),三個(gè)種屬野生型的SAMHD1均具有抗病毒能力,轉(zhuǎn)染了人源和貓?jiān)春硕ㄎ恍盘?hào)缺失的SAMHD1的TZM-bl細(xì)胞更不容易被HIV-2和SIVmac239感染,這說明核定位信號(hào)缺失的h SAMHD1和f SAMHD1的抗病毒能力增強(qiáng)。而對(duì)于牛源SAMHD1,核定位信號(hào)缺失僅能夠增強(qiáng)其抗HIV-2感染的能力,而對(duì)其抗SIVmac239感染的能力則無明顯影響。為了研究三個(gè)種屬SAMHD1在核定位信號(hào)缺失與否時(shí)表現(xiàn)出的抗病毒能力差異是否與Vpx對(duì)SAMHD1的降解作用有關(guān),我們進(jìn)行了隨后的降解實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HEK 293細(xì)胞系中,來源于SIVmac239的Vpx能夠明顯降解homo-SAMHD1,部分降解bovine-SAMHD1,幾乎不能降解feline-SAMHD1。來源于SIVmac239的Vpx Q76A突變體(76位氨基酸是影響Vpx降解SAMHD1的關(guān)鍵位點(diǎn))相比野生型Vpx能夠使homo-SAMHD1和bovine-SAMHD1的降解現(xiàn)象有所回復(fù)。去除核定位信號(hào)后,Vpx對(duì)homo-SAMHD1和bovine-SAMHD1的降解程度也有所回復(fù)。考慮到homo-SAMHD1的CTD區(qū)(C terminal domain)影響其與SIVmac來源的Vpx的結(jié)合,因此結(jié)合種屬間SAMHD1序列比對(duì)結(jié)果,我們認(rèn)為feline-SAMHD1的CTD區(qū)與homo-SAMHD1相比存在個(gè)別氨基酸差異可能是導(dǎo)致其難以被Vpx降解的一個(gè)原因;另一方面我們發(fā)現(xiàn)bovine-SAMHD1并不存在類似homo-SAMHD1的CTD區(qū)域,但是卻仍能夠被Vpx部分降解,因此我們?cè)陔S后檢測(cè)了Vpx與不同種屬野生型以及缺失核定位信號(hào)的SAMHD1的相互作用。結(jié)果顯示,feline/bovine-SAMHD1與homo-SAMHD1類似能夠與Vpx結(jié)合,且核定位信號(hào)的缺失并不影響其與Vpx的結(jié)合。另外,考慮到SAMHD1核定位信號(hào)的缺失可能會(huì)影響其本身作為d NTPase的酶活性以及其發(fā)揮d NTPase功能的場(chǎng)所,進(jìn)而影響其抗病毒能力,因此我們研究了不同種屬SAMHD1的d NTPase功能對(duì)其抗病毒能力的影響。由于SAMHD1的HD區(qū)與d NTPase密切相關(guān),通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)人源SAMHD1的第233位組氨酸(影響SAMHD1的d NTPase功能的關(guān)鍵位點(diǎn))在貓?jiān)?第233位)以及牛源(第221位)的SAMHD1中保守,因此我們構(gòu)建了homo/feline/bovine-SAMHD1H233/221A突變體,并在TZM-bl細(xì)胞系中進(jìn)行了抗病毒感染實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示突變233/221位組氨酸后,三個(gè)種屬SAMHD1抗HIV-1的能力均有所下降,因此我們認(rèn)為SAMHD1的抗病毒作用與其d NTPase活性相關(guān)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將考察核定位信號(hào)是否影響SAMHD1的d NTPase活性和細(xì)胞內(nèi)的d NTP水平。綜上,本論文對(duì)不同種屬SAMHD1的核定位信號(hào)對(duì)其抗病毒能力的影響進(jìn)行了研究,并從SAMHD1與Vpx的拮抗作用、結(jié)合區(qū)域和SAMHD1本身的d NTPase活性方面對(duì)不同種屬SAMHD1在核定位信號(hào)有無時(shí)表現(xiàn)出的抗病毒能力差異進(jìn)行了分析和闡釋。本論文的研究將有助于進(jìn)一步理解SAMHD1發(fā)揮抗病毒能力的具體機(jī)制以及與Vpx的相互作用機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：2387524