【摘要】：家蠶(Bombyx mori)是鱗翅目重要的模式昆蟲,其一生要經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹、成蟲四個發(fā)育過程,蛋白質(zhì)在這些生命過程中執(zhí)行著不同的功能。而蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮要經(jīng)過一系列的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,如甲基化、乙�；�、磷酸化和泛素化修飾等。其中泛素化修飾是泛素蛋白G76甘氨酸識別并結(jié)合底物賴氨酸殘基位點,一方面介導(dǎo)蛋白進入26S蛋白酶體復(fù)合物,使底物蛋白發(fā)生降解,另一方面也可能與底物蛋白結(jié)合發(fā)揮非降解作用,參與其它生物學(xué)過程。同時泛素蛋白也可以形成多聚泛素鏈,被磷酸化、乙�；刃揎�。隨著對泛素化修飾研究的逐步深入,在生物體內(nèi)又發(fā)現(xiàn)一類在結(jié)構(gòu)和進化關(guān)系上與泛素都極為相似的類泛素蛋白家族,如SUMO、NEDD8等。它們在功能上與泛素有較大的差異,同時也可以修飾泛素蛋白鏈。研究發(fā)現(xiàn),類泛素化修飾不僅可以調(diào)控泛素化修飾,間接發(fā)揮降解靶蛋白作用,而且還具有免疫調(diào)節(jié)、DNA損傷修復(fù)、亞細(xì)胞定位和細(xì)胞周期調(diào)控等功能。NEDD8是一類目前發(fā)現(xiàn)的與泛素序列相似度最高的類泛素蛋白,蛋白序列高度保守。目前越來越多的證據(jù)表明NEDDylation修飾在參與細(xì)胞周期調(diào)控方面的作用是必需的。家蠶有關(guān)NEDDylation修飾的研究還鮮有報道,通過本研究我們希望闡釋NEDDylation修飾在家蠶細(xì)胞周期調(diào)控方面的作用,以及鑒定家蠶中發(fā)生NEDDylation修飾的底物蛋白,同時泛素蛋白和類泛素蛋白與底物的修飾位點都是賴氨酸殘基位點,而且多聚泛素鏈可以受到類泛素化修飾,類泛素鏈也可以受到泛素化修飾,幾種修飾之間可能存在競爭與協(xié)同關(guān)系。因此本研究將為今后探討家蠶泛素化修飾與類泛素化修飾之間協(xié)同競爭的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。通過本研究,我們主要得出了以下結(jié)論:(1)家蠶NEDDylation修飾基因的鑒定、表達特征及亞細(xì)胞定位家蠶BmNedd8基因編碼77個氨基酸殘基,蛋白序列高度保守,第76位有保守的二甘氨酸激活位點。進化樹分析發(fā)現(xiàn)家蠶Bm Nedd8與黑脈金斑蝶聚為一支,與物種間進化較為一致。鑒定并克隆了家蠶NEDDylation修飾酶基因,胚胎發(fā)育時期表達特征分析顯示修飾基因在各時期均持續(xù)表達,5齡3天各組織表達特征顯示修飾基因在各組織表達無特異性。BmNedd8在有絲分裂間期主要定位在細(xì)胞核,隨著分裂期的進行,逐漸定位到細(xì)胞質(zhì)和紡錘體,分裂末期,又定位到染色體。其定位與有絲分裂染色體的分布密切相關(guān),暗示家蠶NEDDylation修飾可能參與調(diào)控細(xì)胞周期。(2)家蠶NEDDylation修飾參與細(xì)胞有絲分裂調(diào)控通過合成參與NEDDylation修飾基因的雙鏈RNA,干涉處理BmN4-SID I細(xì)胞,在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上均可以檢測到明顯的干涉效果。干涉處理家蠶細(xì)胞NEDDylation修飾基因,導(dǎo)致細(xì)胞周期分布出現(xiàn)G2/M期滯留現(xiàn)象,表明NEDDylation修飾可以調(diào)控細(xì)胞周期。同時干涉掉修飾基因的細(xì)胞導(dǎo)致有絲分裂中期染色體的排布發(fā)生紊亂,無法定向排列于赤道板,紡錘體無法與染色體結(jié)合將其拉向細(xì)胞兩極從而導(dǎo)致細(xì)胞停留在分裂期,引起G2/M期細(xì)胞數(shù)增多,表明NEDDylation修飾可以通過影響染色體的排布進而調(diào)控細(xì)胞周期進程。(3)家蠶NEDDylation修飾底物的鑒定與功能分析通過構(gòu)建融合FLAG標(biāo)簽蛋白的BmNedd8野生型與BmNedd8羧基端GG識別位點缺失型和GG→AA突變型轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系,免疫沉淀富集底物蛋白和LC-MS/MS鑒定,一共鑒定到了58個發(fā)生特異修飾的底物蛋白。其中31%為已報道的與核糖體形成相關(guān)蛋白。此外,還有豐度較高的與有絲分裂紡錘體微管形成相關(guān)蛋白:肌動蛋白、β-Tubulin蛋白等,與代謝相關(guān)的ATP合成酶等,與SUMOylation修飾相關(guān)的SUMO E3連接酶RanBP2,表明家蠶細(xì)胞可能通過對這些底物蛋白的修飾從而參與調(diào)控細(xì)胞周期和基礎(chǔ)代謝進程。底物蛋白修飾位點附近氨基酸較為靈活,無保守基序。GO功能分析顯示多數(shù)蛋白參與色素沉著和代謝進程,部分蛋白也參與到胞內(nèi)組分的定位、免疫調(diào)節(jié)、核糖體結(jié)構(gòu)形成等。
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【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q23

【參考文獻】

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1 肖寧;程金科;;蛋白質(zhì)SUMO化修飾及其調(diào)控[J];生命的化學(xué);2015年02期

2 李楊;李棟;;泛素連接酶-底物選擇關(guān)系的研究進展[J];生物技術(shù)通報;2015年01期

3 胡高磊;劉英;伍會健;;NEDD化修飾系統(tǒng)及其在腫瘤發(fā)展中的作用[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2014年09期

4 阮班軍;代鵬;王偉;孫建斌;張文濤;顏真;楊靜華;;蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究進展[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報;2014年07期

5 陳季武;鄭麗娜;王幫正;李曉濤;;泛素化介導(dǎo)的非蛋白質(zhì)降解功能[J];生物化學(xué)與生物物理進展;2012年07期

6 畢海連;洪永德;伍會健;;SUMO化修飾與DNA損傷修復(fù)[J];生理科學(xué)進展;2011年02期

7 袁浩;朱軍;;蛋白質(zhì)的類泛素化修飾[J];生命科學(xué);2010年11期

8 何珊;張令強;賀福初;;類泛素化修飾Neddylation的功能和調(diào)控機制研究進展[J];生物化學(xué)與生物物理進展;2009年09期

9 劉，

本文編號：2314099