【摘要】：目的:探討Micro RNA-146b-5p(mi R-146b-5p)的生物學(xué)性能,檢測(cè)其對(duì)小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞(DC)成熟的影響,以及對(duì)小鼠骨片來源間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)成脂分化能力的影響。方法:(1)從C57BL/6小鼠骨髓中分離CD11b+單核細(xì)胞,并對(duì)其進(jìn)行5-7天的誘導(dǎo)分化,使其成為未成熟DC(i DC)和成熟DC(m DC),采用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)其細(xì)胞表型。對(duì)單核細(xì)胞及不同時(shí)期的DC進(jìn)行Micro RNA芯片分析,依據(jù)芯片結(jié)果選擇在DC成熟過程中高表達(dá)的mi RNAs,并通過熒光定量PCR(q-PCR)進(jìn)一步驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)mi R-146b-5p在分化過程中高表達(dá)且變化顯著。進(jìn)一步,將mi R-146b-5p mimics或inhibitors轉(zhuǎn)染小鼠骨髓CD11b+單核細(xì)胞,吞噬實(shí)驗(yàn)和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)檢測(cè)mi R-146b-5p對(duì)DC成熟的影響。(2)從C57BL/6小鼠骨實(shí)質(zhì)中分離培養(yǎng)MSC,并經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鑒定其表型。q-PCR檢測(cè)骨實(shí)質(zhì)來源的MSC在誘導(dǎo)成脂過程中,細(xì)胞內(nèi)mi R-146b-5p表達(dá)水平的改變。將mi R-146b-5p mimics或inhibitors轉(zhuǎn)染MSC并檢測(cè)其成脂分化能力的改變。培養(yǎng)14d后,油紅O染色鑒定其成脂分化能力,并通過q-PCR檢測(cè)成脂分化因子C/EBPα和PPARγ的表達(dá),Western Blot檢測(cè)PPARγ蛋白的表達(dá),以闡述mi R-146b-5p對(duì)小鼠骨實(shí)質(zhì)來源的MSC成脂分化能力的影響。結(jié)果:(1)我們采用免疫磁珠法成功分離出小鼠骨髓來源的CD11b+單核細(xì)胞,并誘導(dǎo)成i DC和m DC。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明,小鼠骨髓來源的i DC低表達(dá)CD80、CD86、CD11c、MHCⅡ,高表達(dá)CD11b;小鼠骨髓來源的m DC高表達(dá)CD80、CD86、CD11c、MHCⅡ,低表達(dá)CD11b,符合i DC和m DC的表型特征。對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行比較篩查,發(fā)現(xiàn)mi R-146b-5p、mi R-21a-5p、mi R-690、mi R-223-3p、mi R-155-5p、mi R-107-3p、mi R-1224-5p和mi R-5112等在單核細(xì)胞向DC發(fā)育成熟過程中表達(dá)量較高且差異顯著,經(jīng)由q PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)mi R-146b-5p具有顯著改變。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),小鼠骨髓來源的CD11b+單核細(xì)胞在誘導(dǎo)DC成熟的過程中,mi R-146b-5p的表達(dá)量隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加而降低(p0.01)。將mi R-146b-5p mimics或inhibitors轉(zhuǎn)染小鼠骨髓CD11b+單核細(xì)胞,吞噬實(shí)驗(yàn)和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)mi R-146b-5p對(duì)DC成熟的調(diào)控作用,結(jié)果表明,mi R-146b-5p缺失可導(dǎo)致單核細(xì)胞的吞噬能力顯著降低,表現(xiàn)為成熟DC表型。MLR檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染mimics會(huì)降低DC對(duì)T細(xì)胞的刺激能力。(2)成功分離出小鼠骨實(shí)質(zhì)來源的MSC,并符合MSC的典型特征,即細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形,高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29和CD105,高表達(dá)干性表面標(biāo)志物Sca-1,不表達(dá)內(nèi)皮表面標(biāo)志物CD31、不表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD11b、CD45和主要組織相容性復(fù)合體MHCⅡ以及CD140a。通過q-PCR檢測(cè)骨實(shí)質(zhì)來源的MSC在誘導(dǎo)成脂過程中mi R-146b-5p的表達(dá),結(jié)果顯示,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加,mi R-146b-5p的表達(dá)亦顯著增加,7d后趨于平穩(wěn)(p0.01)。將mi R-146b-5p mimics或inhibitors轉(zhuǎn)染MSC,可有效改變細(xì)胞內(nèi)mi R-146b-5p的表達(dá)。與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染mi R-146b-5p mimics后細(xì)胞表達(dá)mi R-146b-5p顯著上調(diào)(p0.001),轉(zhuǎn)染mi R-146b-5p inhibitors后細(xì)胞表達(dá)mi R-146b-5p顯著下調(diào)(p0.01)。油紅O染色結(jié)果表明,誘導(dǎo)14d后,過表達(dá)mi R-146b-5p可顯著提高分化細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)目和成脂比例;而抑制mi R-146b-5p后可有效阻斷誘導(dǎo)成脂過程,脂滴減少,脂肪細(xì)胞明顯減少。q-PCR檢測(cè)結(jié)果表明,與自分化組相比,轉(zhuǎn)染mi R-146b-5p mimics后細(xì)胞表達(dá)C/EBPα和PPARγ顯著上調(diào)(p0.01),轉(zhuǎn)染mi R-146b-5p inhibitors后細(xì)胞表達(dá)C/EBPα和PPARγ顯著下調(diào)(p0.05)。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染mi R-146b-5p mimics后細(xì)胞表達(dá)PPARγ顯著上調(diào),轉(zhuǎn)染mi R-146b-5p inhibitors后細(xì)胞表達(dá)PPARγ顯著下調(diào)。結(jié)論:mi R-146b-5p inhibitors可促進(jìn)小鼠骨髓CD11b+單核細(xì)胞來源的DC成熟,而mi R-146b-5p mimics可有效促進(jìn)小鼠骨實(shí)質(zhì)來源的MSC向脂肪細(xì)胞分化。上述結(jié)果提示,mi R-146b-5p具有調(diào)控DC發(fā)育成熟和MSC成脂分化的作用,其調(diào)控機(jī)制有待深入探討。
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【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q75

【參考文獻(xiàn)】

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1 宋東強(qiáng);范虞琪;許左雋;殷兆芳;王長(zhǎng)謙;;miRNA-146b對(duì)小鼠c-kit~+心臟干細(xì)胞遷移、增殖、分化能力的影響[J];心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志;2013年02期

2 鄧宇斌,郭小荑,原清濤,李樹濃;Efficiency of adenoviral vector mediated CTLA4Ig gene delivery into mesenchymal stem cells[J];Chinese Medical Journal;2003年11期

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本文編號(hào)：2269605