【摘要】：目的:探討Micro RNA-146b-5p(mi R-146b-5p)的生物學性能,檢測其對小鼠骨髓來源樹突狀細胞(DC)成熟的影響,以及對小鼠骨片來源間充質(zhì)干細胞(MSC)成脂分化能力的影響。方法:(1)從C57BL/6小鼠骨髓中分離CD11b+單核細胞,并對其進行5-7天的誘導分化,使其成為未成熟DC(i DC)和成熟DC(m DC),采用流式細胞術(shù)分別檢測其細胞表型。對單核細胞及不同時期的DC進行Micro RNA芯片分析,依據(jù)芯片結(jié)果選擇在DC成熟過程中高表達的mi RNAs,并通過熒光定量PCR(q-PCR)進一步驗證,發(fā)現(xiàn)mi R-146b-5p在分化過程中高表達且變化顯著。進一步,將mi R-146b-5p mimics或inhibitors轉(zhuǎn)染小鼠骨髓CD11b+單核細胞,吞噬實驗和混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)檢測mi R-146b-5p對DC成熟的影響。(2)從C57BL/6小鼠骨實質(zhì)中分離培養(yǎng)MSC,并經(jīng)流式細胞術(shù)檢測鑒定其表型。q-PCR檢測骨實質(zhì)來源的MSC在誘導成脂過程中,細胞內(nèi)mi R-146b-5p表達水平的改變。將mi R-146b-5p mimics或inhibitors轉(zhuǎn)染MSC并檢測其成脂分化能力的改變。培養(yǎng)14d后,油紅O染色鑒定其成脂分化能力,并通過q-PCR檢測成脂分化因子C/EBPα和PPARγ的表達,Western Blot檢測PPARγ蛋白的表達,以闡述mi R-146b-5p對小鼠骨實質(zhì)來源的MSC成脂分化能力的影響。結(jié)果:(1)我們采用免疫磁珠法成功分離出小鼠骨髓來源的CD11b+單核細胞,并誘導成i DC和m DC。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明,小鼠骨髓來源的i DC低表達CD80、CD86、CD11c、MHCⅡ,高表達CD11b;小鼠骨髓來源的m DC高表達CD80、CD86、CD11c、MHCⅡ,低表達CD11b,符合i DC和m DC的表型特征。對芯片結(jié)果進行比較篩查,發(fā)現(xiàn)mi R-146b-5p、mi R-21a-5p、mi R-690、mi R-223-3p、mi R-155-5p、mi R-107-3p、mi R-1224-5p和mi R-5112等在單核細胞向DC發(fā)育成熟過程中表達量較高且差異顯著,經(jīng)由q PCR檢測發(fā)現(xiàn)mi R-146b-5p具有顯著改變。進一步研究發(fā)現(xiàn),小鼠骨髓來源的CD11b+單核細胞在誘導DC成熟的過程中,mi R-146b-5p的表達量隨著誘導天數(shù)的增加而降低(p0.01)。將mi R-146b-5p mimics或inhibitors轉(zhuǎn)染小鼠骨髓CD11b+單核細胞,吞噬實驗和混合淋巴細胞反應(yīng)檢測mi R-146b-5p對DC成熟的調(diào)控作用,結(jié)果表明,mi R-146b-5p缺失可導致單核細胞的吞噬能力顯著降低,表現(xiàn)為成熟DC表型。MLR檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染mimics會降低DC對T細胞的刺激能力。(2)成功分離出小鼠骨實質(zhì)來源的MSC,并符合MSC的典型特征,即細胞形態(tài)呈長梭形,高表達間質(zhì)細胞表面標志物CD29和CD105,高表達干性表面標志物Sca-1,不表達內(nèi)皮表面標志物CD31、不表達造血細胞表面標志物CD34、CD11b、CD45和主要組織相容性復合體MHCⅡ以及CD140a。通過q-PCR檢測骨實質(zhì)來源的MSC在誘導成脂過程中mi R-146b-5p的表達,結(jié)果顯示,隨著誘導時間的增加,mi R-146b-5p的表達亦顯著增加,7d后趨于平穩(wěn)(p0.01)。將mi R-146b-5p mimics或inhibitors轉(zhuǎn)染MSC,可有效改變細胞內(nèi)mi R-146b-5p的表達。與對照組相比,轉(zhuǎn)染mi R-146b-5p mimics后細胞表達mi R-146b-5p顯著上調(diào)(p0.001),轉(zhuǎn)染mi R-146b-5p inhibitors后細胞表達mi R-146b-5p顯著下調(diào)(p0.01)。油紅O染色結(jié)果表明,誘導14d后,過表達mi R-146b-5p可顯著提高分化細胞內(nèi)脂滴數(shù)目和成脂比例;而抑制mi R-146b-5p后可有效阻斷誘導成脂過程,脂滴減少,脂肪細胞明顯減少。q-PCR檢測結(jié)果表明,與自分化組相比,轉(zhuǎn)染mi R-146b-5p mimics后細胞表達C/EBPα和PPARγ顯著上調(diào)(p0.01),轉(zhuǎn)染mi R-146b-5p inhibitors后細胞表達C/EBPα和PPARγ顯著下調(diào)(p0.05)。Western Blot檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染mi R-146b-5p mimics后細胞表達PPARγ顯著上調(diào),轉(zhuǎn)染mi R-146b-5p inhibitors后細胞表達PPARγ顯著下調(diào)。結(jié)論:mi R-146b-5p inhibitors可促進小鼠骨髓CD11b+單核細胞來源的DC成熟,而mi R-146b-5p mimics可有效促進小鼠骨實質(zhì)來源的MSC向脂肪細胞分化。上述結(jié)果提示,mi R-146b-5p具有調(diào)控DC發(fā)育成熟和MSC成脂分化的作用,其調(diào)控機制有待深入探討。
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【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q75

【參考文獻】

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1 宋東強;范虞琪;許左雋;殷兆芳;王長謙;;miRNA-146b對小鼠c-kit~+心臟干細胞遷移、增殖、分化能力的影響[J];心血管康復醫(yī)學雜志;2013年02期

2 鄧宇斌,郭小荑,原清濤,李樹濃;Efficiency of adenoviral vector mediated CTLA4Ig gene delivery into mesenchymal stem cells[J];Chinese Medical Journal;2003年11期

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本文編號：2269605