【摘要】：轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的體細(xì)胞重編程技術(shù)不僅避免了傳統(tǒng)干細(xì)胞研究的倫理問題;同時(shí)在疾病模型、藥物篩選等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。系統(tǒng)地研究重編程過程中的分子機(jī)制不僅有助于理解細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變的內(nèi)在聯(lián)系,更有助于獲得臨床級(jí)別的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)用于疾病治療。近些年的研究表明環(huán)狀RNA(circRNA)的表達(dá)呈現(xiàn)出細(xì)胞類型特異性且參與調(diào)控大腦神經(jīng)發(fā)育、腫瘤的發(fā)生發(fā)展,暗示其具有重要的生物學(xué)功能。但circRNA在體細(xì)胞重編程和多能性中的研究還未見報(bào)道。本論文第一部分以小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)和體細(xì)胞重編程為模型探索circRNA的生物學(xué)功能。首先采用環(huán)狀RNA測序的方法系統(tǒng)的比較circRNA在胚胎干細(xì)胞和胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)中的表達(dá)差異;然后結(jié)合生物信息學(xué)分析和功能預(yù)測,篩選出特定的circRNA進(jìn)行雙向PCR測序驗(yàn)證;進(jìn)一步針對(duì)特定的circRNA,通過siRNA敲低和過表達(dá)研究其對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞多能性的調(diào)控;最后在OG2MEF細(xì)胞中篩選能夠調(diào)控重編程的circRNA分子。研究發(fā)現(xiàn)circGatad2a,circKdm2a,circMad111過表達(dá)可以穩(wěn)定地促進(jìn)OG2MEF細(xì)胞的重編程效率。進(jìn)一步研究表明這三種環(huán)狀RNAs過表達(dá)能夠不同程度的促進(jìn)重編程后期多能性基因(如Nanog,Pou5f1等)的表達(dá)且不依賴于自身mRNA基因的變化。本論文第二部分基于課題組已有的發(fā)現(xiàn):即敲低抑制復(fù)合物NCoR/SMRT能顯著提高OSKM介導(dǎo)的小鼠體細(xì)胞重編程效率并促進(jìn)多能性基因的表達(dá),進(jìn)一步探索NCoR/SMRT抑制復(fù)合物和重編程因子間的作用關(guān)系。并以此高效重編程系統(tǒng)為模型,初步研究促重編程circRNA表達(dá)的差異。研究發(fā)現(xiàn),重編程因子OSKM都能和NCoR/SMRT復(fù)合物相互作用,但與c-Myc的作用最強(qiáng)。為此我們推測NCoR/SMRT抑制復(fù)合物主要由c-Myc招募去抑制重編程后期多能性基因的激活,從而降低體細(xì)胞重編程的效率,但敲低NCoR/SMRT介導(dǎo)的高效重編程系統(tǒng)并未影響部分促重編程circRNA的表達(dá)。綜上所述,本論文主要研究circRNA在小鼠胚胎干細(xì)胞和體細(xì)胞重編程中的生物學(xué)功能。通過高通量的circRNA測序和系統(tǒng)的功能篩選發(fā)現(xiàn)circRNA circGatad2a,circKdm2a-1#,circMad111可以促進(jìn)體細(xì)胞重編程的效率,具體的分子機(jī)制還有待于后續(xù)研究;另一方面發(fā)現(xiàn)c-Myc參與招募抑制復(fù)合物NCoR/SMRT去抑制多能性基因的激活,并且敲低NCoR/SMRT介導(dǎo)的高效重編程系統(tǒng)并未影響促重編程circRNA的表達(dá)。
[Abstract]:Transcription factor-mediated somatic cell reprogramming not only avoids the ethical problems of traditional stem cell research, but also has a broad application prospect in disease model and drug screening. A systematic study of the molecular mechanisms in the process of reprogramming not only helps to understand the intrinsic relationship of cell fate transition, but also helps to obtain clinically induced pluripotent stem cells (iPSCs) for disease treatment. Recent studies have shown that the expression of cyclic RNA (circRNA) is cell-specific and involved in the regulation of brain neurogenesis and tumor development, suggesting that it has important biological functions. However, the study of circRNA in somatic reprogramming and pluripotency has not been reported. In the first part of this thesis, (mESCs) and somatic cell reprogramming of mouse embryonic stem cells were used as models to explore the biological function of circRNA. The differential expression of circRNA in (MEFs) of embryonic stem cells and embryonic fibroblasts was systematically compared by cyclic RNA sequencing, and then specific circRNA was selected for bidirectional PCR sequencing by bioinformatics analysis and function prediction. Furthermore, the regulation of mouse embryonic stem cell pluripotency was studied by siRNA knockdown and overexpression for specific circRNAs. Finally, the reprogrammed circRNA molecules were screened in OG2MEF cells. It has been found that overexpression of circGatad2atio circKdm2aSc Mad111 can stably promote the reprogramming efficiency of OG2MEF cells. Further studies have shown that these three cyclic RNAs overexpression can promote the expression of polymorphic genes (such as Nanog-Pou5f1, etc.) in the later stage of reprogramming, and do not depend on the changes of their own mRNA genes. The second part of this thesis is based on the findings of the research group: knock down inhibition complex NCoR/SMRT can significantly improve the efficiency of OSKM mediated somatic cell reprogramming and promote the expression of pluripotent genes in mice. To further explore the interaction between NCoR/SMRT inhibitory complex and reprogramming factor. Based on the model of high efficiency reprogramming system, the difference of circRNA expression in accelerated reprogramming is preliminarily studied. It was found that the reprogramming factor OSKM could interact with NCoR/SMRT complex, but had the strongest effect with c-Myc. Therefore, we speculate that the NCoR/SMRT inhibitory complex is mainly recruited by c-Myc to suppress the activation of pluripotent genes in the late stage of reprogramming, thus reducing the efficiency of somatic reprogramming. But knock-down NCoR/SMRT-mediated high-efficiency reprogramming system did not affect the expression of partial re-programming circRNA. To sum up, the biological function of circRNA in mouse embryonic stem cell and somatic cell reprogramming was studied. Through high-throughput circRNA sequencing and systematic functional screening, it was found that circRNA circGatad2ahongcircKdm2a-#1 circMad111 could promote the efficiency of somatic cell reprogramming, and the specific molecular mechanism needed to be further studied. On the other hand, it was found that c-Myc was involved in the recruitment of inhibition complex NCoR/SMRT to inhibit the activation of pluripotent genes, and knockdown of NCoR/SMRT mediated high efficiency reprogramming system did not affect the expression of circRNA.
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：2166392