本文選題：四環(huán)素誘導(dǎo)型表達(dá)載體 + 轉(zhuǎn)分化　； 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：分化成熟的體細(xì)胞不經(jīng)過中間的多能性狀態(tài)而直接通過轉(zhuǎn)分化轉(zhuǎn)變成其他類型的體細(xì)胞或者成體干細(xì)胞的過程稱作譜系重編程。在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Mouse Embryonic Fibroblast cells,MEFs)中表達(dá)肝臟器官發(fā)生中起重要作用的兩個轉(zhuǎn)錄因子Hnf1β和Foxa3,將其誘導(dǎo)為肝干細(xì)胞(induced hepatic stem cells,i Hep SCs)的成功,是該研究領(lǐng)域的一項重要成果,然而其重編程過程中所涉及的分子機(jī)制卻尚不清楚。四環(huán)素控制的誘導(dǎo)型表達(dá)載體是研究重編程進(jìn)程的非常有用的工具。2008年,Brambrink和Stadtfeld就曾經(jīng)利用這個體系揭示了MEF重編程為i PSCs細(xì)胞的時間進(jìn)程,他們從整合了Oct4-GFP等位基因及四環(huán)素控制元件反式作用因子基因M2rt TA的小鼠中分離MEF細(xì)胞,該小鼠所攜帶的GFP報告基因可以顯示內(nèi)源性O(shè)ct4基因的激活情況,并表示細(xì)胞重編程的成功。借鑒體細(xì)胞重編程機(jī)制研究的經(jīng)驗,重編程的時間進(jìn)程的確定可以說是研究細(xì)胞重編程過程中相關(guān)機(jī)制的研究基礎(chǔ)之一,而構(gòu)建高效可控的雙因子慢病毒表達(dá)載體則是研究重編程進(jìn)程的基礎(chǔ),所以四環(huán)素控制的Hnf1β和Foxa3表達(dá)載體的構(gòu)建對本課題研究的開展十分重要。細(xì)胞重編程過程與胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化過程有一個共同點是細(xì)胞都經(jīng)歷原有細(xì)胞表觀標(biāo)記的去除和新的細(xì)胞特異的表觀修飾的建立,其中DNA甲基化與DNA去甲基化導(dǎo)致的細(xì)胞DNA甲基化模式的改變被認(rèn)為是其中具有重要調(diào)控作用的機(jī)制。近年來多項研究證明Tet家族(Tet1、Tet2、Tet3)可以催化5-甲基胞嘧啶(5-m C)轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hm C),從而實現(xiàn)DNA的主動去甲基化,而大量研究證明,Tet1在體細(xì)胞重編程中具有十分重要的作用。本課題著重于Tet家族成員在MEF細(xì)胞重編程為i Hep SCs中的作用開展了初步研究。我們首先構(gòu)建了四環(huán)素誘導(dǎo)型的Hnf1β和Foxa3轉(zhuǎn)錄因子慢病毒表達(dá)載體,感染小鼠成纖維細(xì)胞后利用多西環(huán)素(doxycycline,Dox)來控制外源雙因子的表達(dá)并觀察細(xì)胞重編程的過程。我們利用這兩個表達(dá)報告基因EGFP和m Cherry的表達(dá)載體成功獲得了轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞克隆,通過鑒定發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的細(xì)胞在形態(tài)上與i Hep SCs相似,在轉(zhuǎn)錄水平上,表達(dá)膽管細(xì)胞的標(biāo)志(CK19)、肝膽共同標(biāo)志(CK18)以及一些肝臟干/前體細(xì)胞標(biāo)志(Dlk1、Sox9、Ep CAM)。該結(jié)果證明我們初步建立了四環(huán)素控制的MEF細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為i Hep SCs的誘導(dǎo)體系。另外我們還發(fā)現(xiàn),將獲得的重編程細(xì)胞培養(yǎng)在撤掉Dox的i Hep SCs培養(yǎng)液中,細(xì)胞的干性特征在許多方面發(fā)生了變化,提示我們所獲得的細(xì)胞中,外源基因的表達(dá)在其干性維持中起著非常重要的作用。該體系的建立為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。然后,我們利用q RT-PCR和免疫熒光染色方法證明了Tet家族成員在MEF重編程為i Hep SCs過程中的表達(dá)激活,同時也證明了其在i Hep SCs細(xì)胞中的表達(dá)維持,這些都提示了Tet家族的重要作用。與其表達(dá)相一致,細(xì)胞中5m C和5hm C的水平也發(fā)生了相應(yīng)的變化。我們將利用Dox誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)對重編程過程中的細(xì)胞在不同的時間點進(jìn)行取樣,對這個過程中Tet表達(dá)水平及細(xì)胞甲基化和羥甲基化水平的變化規(guī)律做深入研究,并揭示該過程中轉(zhuǎn)錄組表達(dá)變化與甲基化水平變化之間的相關(guān)性�？傊�,本研究中我們建立了四環(huán)素誘導(dǎo)型的Hnf1β和Foxa3轉(zhuǎn)錄因子慢病毒表達(dá)載體并成功地建立了轉(zhuǎn)分化的誘導(dǎo)體系,獲得了由MEF細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而來的誘導(dǎo)型肝干細(xì)胞,并初步證明了Tet家族在重編程過程和干細(xì)胞干性維持中的重要作用,為后續(xù)研究打下了基礎(chǔ)。
[Abstract]:In 2008 , it has been proved that Tet1 , Tet2 , Tet3 can catalyze 5 - methylcytosine ( 5 - m C ) to transform into 5 - hydroxymethyl cytosine ( 5 - hm C ) . In conclusion , we have established the expression vector of Hnf1 & beta ; and Foxa3 transcription factor slow virus in the process of reprogramming , and also demonstrated the correlation between the expression of exogenous gene and the change of methylation level in the cells .
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R329.2

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7 李U，

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