本文選題：四氫嘧啶及5-羥基四氫嘧啶 + 四氫嘧啶羥化酶　； 參考：《天津科技大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：四氫嘧啶及5-羥基四氫嘧啶在精細(xì)化工、生物醫(yī)藥、生物制造及生產(chǎn)、環(huán)保等領(lǐng)域有廣泛的用途及應(yīng)用前景。四氫嘧啶羥化酶能以Fe2+為輔因子、α-酮戊二酸為輔底物,催化四氫嘧啶轉(zhuǎn)化為5-羥基四氫嘧啶,是微生物發(fā)酵生產(chǎn)5-羥基四氫嘧啶過程中的關(guān)鍵酶。蛋白質(zhì)晶體學(xué)利用X射線衍射技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,使我們從原子角度了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息,結(jié)合蛋白質(zhì)的功能特性,確定在實(shí)際催化過程中的功能基團(tuán)及其作用方式,為定向改造提供重要信息。本文以Bacillus pseudofirmus OF4菌株中的四氫嘧啶羥化酶EctD為研究對(duì)象,從其表達(dá)、純化以及結(jié)晶等方面展開深入研究。利用基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒EctD-pET-22b (+),并在E. coli BL21 (DE3)實(shí)現(xiàn)了高效可溶性表達(dá),經(jīng)Ni-NTA親和層析、SuperdexTM20010/300 GL分子篩層析、Resource Q離子交換層析純化過程后,得到純度大于95%的目的蛋白。利用商業(yè)結(jié)晶試劑盒通過懸滴和坐滴氣象擴(kuò)散法對(duì)目的蛋白的結(jié)晶條件進(jìn)行篩選。通過進(jìn)一步結(jié)晶條件優(yōu)化,在0.2 mol/L MgCl2,0.1 mol/L BIS-TRIS (pH 6.5),25% (g/mL) PEG 3,350,目的蛋白濃度為6.5 mg/ml結(jié)晶條件,運(yùn)用坐滴氣象擴(kuò)散法下獲得了高分辨率的目的蛋白晶體樣本。最終收集到分辨率為2.40A的EctD晶體的衍射數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)處理結(jié)果顯示：EctD晶體屬于三斜晶系,空間群為P1晶胞參數(shù)為a=45.183 A, b=58.871 A, c= 68.812A, a=77.478°, p=86.034°, 7=66.966°。采用原子置換法(MR),成功解析了EctD的三維結(jié)構(gòu)。一個(gè)晶胞由兩個(gè)蛋白質(zhì)分子組成,每個(gè)單體由9個(gè)α螺旋和9個(gè)β折疊通過轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和loop結(jié)構(gòu)鏈接形成。EctD晶體結(jié)構(gòu)的解析為我們深入理解四氫嘧啶羥化酶的酶結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能提供重要的指導(dǎo)信息。另外,針對(duì)該蛋白與輔底物α-酮戊二酸及底物四氫嘧啶的復(fù)合物結(jié)晶工作在進(jìn)一步進(jìn)行中,其中EctD與α-酮戊二酸復(fù)合物晶體X-射線衍射分辨率達(dá)到3.50A,復(fù)合物晶體尚需進(jìn)一步優(yōu)化。
[Abstract]:Tetrahydropyrimidine and 5-hydroxytetrahydropyrimidine are widely used and applied in fine chemical industry, biomedicine, biological manufacture and production, environmental protection and so on. Tetrahydropyrimidine hydroxylase can catalyze the conversion of tetrahydropyrimidine to 5-hydroxy tetrahydropyrimidine by using Fe _ 2 as cofactor and 偽 -ketoglutaric acid as coagent, which is the key enzyme in the production of 5-hydroxytetrahydropyrimidine by microbial fermentation. Protein crystallography uses X-ray diffraction to analyze the structure of proteins, which enables us to understand the structural information of proteins from an atomic point of view and to combine the functional properties of proteins. The functional groups and their action modes in the actual catalytic process are determined to provide important information for directional transformation. In this paper, the tetrahydropyrimidine hydroxylase EctD from Bacillus pseudofirmus OF4 was used as the research object, and its expression, purification and crystallization were studied. The recombinant expression plasmid EctD-pET-22b was successfully constructed by genetic engineering technique and expressed in E. coli BL21 / DE3. The recombinant plasmid was purified by Ni-NTA affinity chromatography and SuperdexTM20010 / 300GL molecular sieve chromatography with Resource Q ion exchange chromatography. The purity of the target protein was more than 95%. The commercial crystallization kit was used to screen the crystallization conditions of the target protein by the method of droplet and droplet meteorological diffusion. By optimizing the crystallization conditions, the high resolution target protein crystal samples were obtained under the conditions of 0.2 mol / L MgCl _ 2 O _ 1 0.1 mol / L BIS-TRIS pH 6.5% g 路mL ~ (-1) PEG _ (3) O _ (350) and the target protein concentration of 6.5 mg/ml. Finally, the diffraction data of EctD crystal with a resolution of 2.40A were collected. The data processing results show that the crystal belongs to the triclinic system, and the space group is: P1 unit cell parameter (AH45.183 A), BX (58.871 A), c = 68.812A, av 77.478 擄, ptd 86.034 擄, 76.966 擄. The 3D structure of EctD was successfully analyzed by atom replacement method. A unit cell is made up of two protein molecules, The analysis of the crystal structure of .EctD formed by 9 偽 helix and 9 尾 folds of each monomer through angular structure and loop structure provides important guidance information for us to deeply understand the enzyme structure and biological function of tetrahydropyrimidine hydroxylase. In addition, the complex crystallization of the protein with substrates 偽 -ketoglutaric acid and substrate-tetrahydropyrimidine is in progress. The X-ray diffraction resolution of EctD and 偽 -ketoglutaric acid complex crystals is 3.50A, and the complex crystals need to be further optimized.
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q814

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本文編號(hào)：2036878