本文選題：谷氨酸棒桿菌 + 血紅素轉(zhuǎn)運蛋白��； 參考：《山東大學》2017年碩士論文

【摘要】：血紅素是普遍存在于生物體內(nèi)的一種生物大分子,它可以作為輔基參與生物的多種生命代謝活動,同時,還可以為生物體提供鐵元素。但過量的游離血紅素具有毒害作用,谷氨酸棒桿菌中存在精致且復雜的調(diào)控系統(tǒng)來確保生物體內(nèi)血紅素的動態(tài)平衡。我們在利用谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)ALA時,菌體積累過量下游產(chǎn)物,致使菌體的生長乃至呼吸代謝均受到影響。鑒于血紅素的重要生理功能,在利用重組菌生產(chǎn)ALA時,血紅素合成途徑不能被阻斷或敲除,只能調(diào)控弱化。谷氨酸棒桿菌中的血紅素受到兩個雙組份系統(tǒng)HrrSA和ChrSA的調(diào)控作用,主要在轉(zhuǎn)錄水平上進行調(diào)控。HrrSA主要用來調(diào)控血紅素合成途徑基因轉(zhuǎn)錄水平,以及血紅素代謝途徑相關基因轉(zhuǎn)錄水平。ChrSA只有胞內(nèi)游離血紅素的濃度超過菌體耐受性時才轉(zhuǎn)錄表達,激活血紅素外運蛋白HrtBA基因表達,將胞內(nèi)過量的游離血紅素轉(zhuǎn)運到胞外。本論文首先構建了谷氨酸棒桿菌血紅素外運蛋白基因單敲菌株WT-H,血紅素外運蛋白與內(nèi)運蛋白基因同時缺失菌株WT-HH。研究血紅素在胞內(nèi)積累時,對血紅素合成途徑以及代謝調(diào)控途徑的影響。結果表明,菌體血紅素轉(zhuǎn)運蛋白缺失,胞內(nèi)游離血紅素的量維持動態(tài)平衡。菌株積累大量的血紅素代謝中間產(chǎn)物,并分泌到胞外。負責調(diào)節(jié)胞內(nèi)游離血紅素動態(tài)平衡的兩個雙組份系統(tǒng)HrrSA與ChrSA的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),血紅素合成途徑基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),血紅素氧化酶基因轉(zhuǎn)錄水平與血紅素結合蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào)。這是由于游離血紅素在胞內(nèi)積累,菌體通過雙組份系統(tǒng)調(diào)控胞內(nèi)游離血紅素的動態(tài)平衡。我們在谷氨酸棒桿菌hemB基因C端添加降解標簽,可有效降低胞內(nèi)ALA脫水酶的活性,菌體積累的膽色素原明顯降低,卟啉化合物的積累量也降低。敲除血紅素轉(zhuǎn)運蛋白基因,菌體胞內(nèi)游離血紅素的量仍可以保持動態(tài)平衡。其次我們在野生型谷氨酸棒桿菌與血紅素轉(zhuǎn)運蛋白基因缺失菌中過表達ALA合成基因,研究過量合成ALA時,對血紅素代謝調(diào)控的影響。ALA過量積累時,胞內(nèi)游離血紅素的量維持動態(tài)平衡;血紅素轉(zhuǎn)運蛋白的缺失有利于提高ALA的積累。此時,菌液顏色加深,發(fā)酵液中積累大量的卟啉化合物。雙組份基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),血紅素合成途徑基因轉(zhuǎn)錄水平也上調(diào)。這是由于胞內(nèi)過量的ALA促使下游代謝提高,積累過量的中間代謝產(chǎn)物。同時菌體雙組份系統(tǒng)調(diào)節(jié)胞內(nèi)血紅素動態(tài)平衡。在hemB基因末端添加降解標簽可有效提高ALA的積累。綜上所述,血紅素轉(zhuǎn)運蛋白缺失,胞內(nèi)游離血紅素的量維持動態(tài)平衡,菌體積累大量的卟啉化合物。菌株主要通過雙組份系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控胞內(nèi)游離血紅素的量,抑制血紅素合成途徑基因轉(zhuǎn)錄水平,提高血紅素代謝相關基因轉(zhuǎn)錄水平。降低ALA下游代謝產(chǎn)物的積累可有效提高ALA的產(chǎn)量。研究谷氨酸棒桿菌血紅素轉(zhuǎn)運蛋白缺失對血紅素代謝調(diào)控的影響,可以為后期研究血紅素以及ALA提供理論依據(jù)。
[Abstract]:Heme is a kind of biological macromolecule, which is ubiquitous in organisms. It can be used as an auxiliary group to participate in many biological metabolism activities of organisms, and also provide iron elements for organisms. But excessive free heme has toxic effects. There is a sophisticated and complex regulatory system in Corynebacterium glutaminus to ensure blood red in living organisms. During the production of ALA with Corynebacterium glutamis, the bacteria accumulated over the downstream products, causing the growth of the bacteria and even the respiratory metabolites to be affected. In view of the important physiological function of heme, the heme synthesis pathway can not be blocked or knocked out when the recombinant bacteria are used to produce ALA. The glutamic rod can only be regulated and weakened. The heme of the bacteria is regulated by two bicomponent systems HrrSA and ChrSA. The regulation of.HrrSA mainly at the transcriptional level is mainly used to regulate the transcriptional level of the heme synthesis pathway gene, as well as the transcription level of the heme metabolic pathway related gene.ChrSA only when the concentration of intracellular free heme exceeds the bacterial tolerance. The expression of heme exoprotein HrtBA activates the expression of the heme exoprotein gene and transtransport the intracellular free heme to the extracellular. Firstly, the heme exoprotein gene WT-H, heme exoprotein and the endosin gene are simultaneously missing from the heme strain WT-HH. to study the heme accumulation of heme in the cell. The results showed that the heme transporter was missing and the amount of intracellular free heme maintained dynamic balance. The strain accumulated a large number of intermediate products of heme metabolism and secreted to the extracellular. The transfer of the two components of the intracellular free heme, HrrSA and ChrSA, was responsible for regulating the dynamic balance of intracellular free heme. The transcriptional level of heme synthesis pathway is down regulated, the transcription level of heme oxidase gene and the transcription level of heme binding protein gene are all up-regulated. This is due to the accumulation of heme in the cell and the dynamic balance of intracellular free heme by the bicomponent system. We are in the hemB base of Corynebacterium glutamias. The activity of intracellular ALA dehydrase was effectively reduced because of the addition of degradation labels at the C end. The accumulation of bacterial pigments in the mycelium was significantly reduced and the accumulation of porphyrin compounds decreased. The amount of intracellular free heme in the cell could remain dynamic balance. When the ALA gene was overexpressed in the protein gene deletion bacteria, the amount of intracellular free heme maintained dynamic balance when excessive accumulation of heme metabolism, and the loss of heme transporter was beneficial to the accumulation of ALA when excessive accumulation of ALA in the heme metabolism regulation. The color of the heme transporter was beneficial to the accumulation of ALA. At this time, the color of the bacteria was deepened and the accumulation of porphyrin in the fermented liquid was great. The transcriptional level of the bicomponent gene was up-regulated and the transcriptional level of the heme synthesis pathway was also up-regulated. This is due to the excessive intracellular ALA that promotes downstream metabolism and accumulates excessive intermediate metabolites. At the same time, the bicomponent system regulates the dynamic balance of intracellular heme. The addition of degradation labels at the end of the hemB gene can effectively improve the product of ALA. To sum up, the heme transporter is missing, the amount of intracellular free heme maintains dynamic balance, and the bacteria accumulate a large number of porphyrin compounds. The strain mainly regulates the amount of intracellular free heme at the transcriptional level, inhibits the transcription level of heme synthesis pathway gene, and improves the transcription water of heme metabolism related genes. Lowering the accumulation of metabolites in the downstream ALA can effectively improve the production of ALA. The study of the effect of heme metabolism in heme of Corynebacterium glutamatsu can provide a theoretical basis for the later study of heme and ALA.
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q51

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