本文選題：大豆 + PM18��； 參考：《深圳大學》2017年碩士論文

【摘要】：固有無序蛋白是一類在天然狀態(tài)下沒有穩(wěn)定的二級或三級結構,局部或整體不發(fā)生折疊,但依舊可以行使正常生物學功能的一類蛋白質。這類蛋白參與多種生理過程,可通過與蛋白質、核酸、脂類、金屬離子及小分子等多種分子結合,在分子調控網(wǎng)絡中發(fā)揮多種功能,也可在植物響應逆境脅迫中發(fā)揮重要作用,因此IDPs在提高作物抗逆性中具有潛在應用價值。LEA蛋白是一類典型的固有無序蛋白,可被低溫、干旱、高鹽等非生物脅迫誘導表達。在脅迫條件下,LEA蛋白具有維持蛋白活性、抑制蛋白發(fā)生聚集、穩(wěn)定蛋白構象及保護膜結構等多種功能。目前已有大量轉基因實驗證實第3組LEA蛋白在植物體中的過表達可以提高宿主植物的抗逆性。大豆PM18蛋白屬于第3組LEA蛋白,我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)該基因可以提高大腸桿菌、酵母及擬南芥的耐鹽性,但發(fā)揮作用的機制尚未見報道。由于固有無序蛋白的無序特性使其在分子網(wǎng)絡中經(jīng)常通過與不同結構的靶蛋白發(fā)生結合,參與不同生理過程從而發(fā)揮作用,所以我們推測其可與其他蛋白質發(fā)生相互作用在植物抵抗逆境脅迫時發(fā)揮保護功能。因此,我們以篩選大豆耐鹽蛋白PM18的互作蛋白作為切入點,以進一步揭示LEA蛋白的耐鹽機制。為了進一步探究PM18蛋白的耐鹽機制,首先采用生物信息學的方法預測對PM18蛋白進行預測,利用在線網(wǎng)站STRING對其互作蛋白進行預測,結果顯示大豆PM30和PM32蛋白和大豆PM18蛋白最有可能存在相互作用關系。通過PSORT Ⅱ和Plant-PLoc對PM18蛋白進行亞細胞定位,預測結果顯示位于細胞核,同時利用三種不同軟件metaPrDOS、DISOPRED和IUPred對PM18蛋白的無序程度作出預測,結果發(fā)現(xiàn)PM18蛋白的N端(0-30位)及C端(300-309位)呈現(xiàn)出很強的無序性,其含有8個保守結構域的區(qū)域(113-205位)應為有序結構。然后選用200mMNaCl高鹽脅迫后大豆的根和葉為材料,采用SMART法構建大豆cDNA文庫,片段化檢測結果顯示插入的片段大小在0.5～5.0Kbp之間,平均為1000bp,滴定檢測的滴度為4×104cfu/ml,文庫質量較好,符合后期酵母雙雜交的實驗需求。然后,通過PCR方法從大豆cDNA中克隆出PM18基因,經(jīng)測序鑒定無誤后,成功構于載體PGBKT7。將pGBKT7-PM18和pGADT7質粒共轉化至酵母菌株AH109中,檢測誘餌蛋白不存在自激活現(xiàn)象,可以利用酵母雙雜交系統(tǒng)進行篩選且篩庫不需要添加3AT。最后利用酵母雙雜交系統(tǒng)進行篩選,將pGBKT7-PM18的質粒與大豆cDNA文庫的質粒共轉至酵母菌株AH109,篩選23個陽性克隆,回轉驗證后得到17個有效的陽性克隆,經(jīng)測序分析共有6個讀碼框正確且位于CDS內的基因片段,通過NCBI對基因序列片段進行查找,全長序列分別為 LOC100170728,MYB173,LOC100499708,LOC100306286,LOC100500540,LOC100038325。利用在線網(wǎng)站對得到的6個蛋白的基本信息及氨基酸序列進行分析,通過PCR方法從大豆cDNA中成功得到5個基因片段的全長序列,并成功構建于PGADT7載體上,再次采用回轉驗證的方法,將其分別與pGBKT7-PM18共轉至酵母菌中,結果顯示大豆LOC100170728和MYB173所編碼的蛋白與大豆抗鹽蛋白蛋白可能存在相互作用關系。
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【學位授予單位】：深圳大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q946

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1 孫楠;大豆抗鹽蛋白PM18互作蛋白的篩選及分析[D];深圳大學;2017年

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本文編號：1765590