本文選題：大豆 + PM18��； 參考：《深圳大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：固有無序蛋白是一類在天然狀態(tài)下沒有穩(wěn)定的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu),局部或整體不發(fā)生折疊,但依舊可以行使正常生物學(xué)功能的一類蛋白質(zhì)。這類蛋白參與多種生理過程,可通過與蛋白質(zhì)、核酸、脂類、金屬離子及小分子等多種分子結(jié)合,在分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮多種功能,也可在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要作用,因此IDPs在提高作物抗逆性中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。LEA蛋白是一類典型的固有無序蛋白,可被低溫、干旱、高鹽等非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。在脅迫條件下,LEA蛋白具有維持蛋白活性、抑制蛋白發(fā)生聚集、穩(wěn)定蛋白構(gòu)象及保護(hù)膜結(jié)構(gòu)等多種功能。目前已有大量轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)第3組LEA蛋白在植物體中的過表達(dá)可以提高宿主植物的抗逆性。大豆PM18蛋白屬于第3組LEA蛋白,我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)該基因可以提高大腸桿菌、酵母及擬南芥的耐鹽性,但發(fā)揮作用的機(jī)制尚未見報(bào)道。由于固有無序蛋白的無序特性使其在分子網(wǎng)絡(luò)中經(jīng)常通過與不同結(jié)構(gòu)的靶蛋白發(fā)生結(jié)合,參與不同生理過程從而發(fā)揮作用,所以我們推測(cè)其可與其他蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用在植物抵抗逆境脅迫時(shí)發(fā)揮保護(hù)功能。因此,我們以篩選大豆耐鹽蛋白PM18的互作蛋白作為切入點(diǎn),以進(jìn)一步揭示LEA蛋白的耐鹽機(jī)制。為了進(jìn)一步探究PM18蛋白的耐鹽機(jī)制,首先采用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)對(duì)PM18蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè),利用在線網(wǎng)站STRING對(duì)其互作蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果顯示大豆PM30和PM32蛋白和大豆PM18蛋白最有可能存在相互作用關(guān)系。通過PSORT Ⅱ和Plant-PLoc對(duì)PM18蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位,預(yù)測(cè)結(jié)果顯示位于細(xì)胞核,同時(shí)利用三種不同軟件metaPrDOS、DISOPRED和IUPred對(duì)PM18蛋白的無序程度作出預(yù)測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)PM18蛋白的N端(0-30位)及C端(300-309位)呈現(xiàn)出很強(qiáng)的無序性,其含有8個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的區(qū)域(113-205位)應(yīng)為有序結(jié)構(gòu)。然后選用200mMNaCl高鹽脅迫后大豆的根和葉為材料,采用SMART法構(gòu)建大豆cDNA文庫,片段化檢測(cè)結(jié)果顯示插入的片段大小在0.5～5.0Kbp之間,平均為1000bp,滴定檢測(cè)的滴度為4×104cfu/ml,文庫質(zhì)量較好,符合后期酵母雙雜交的實(shí)驗(yàn)需求。然后,通過PCR方法從大豆cDNA中克隆出PM18基因,經(jīng)測(cè)序鑒定無誤后,成功構(gòu)于載體PGBKT7。將pGBKT7-PM18和pGADT7質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至酵母菌株AH109中,檢測(cè)誘餌蛋白不存在自激活現(xiàn)象,可以利用酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行篩選且篩庫不需要添加3AT。最后利用酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行篩選,將pGBKT7-PM18的質(zhì)粒與大豆cDNA文庫的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)至酵母菌株AH109,篩選23個(gè)陽性克隆,回轉(zhuǎn)驗(yàn)證后得到17個(gè)有效的陽性克隆,經(jīng)測(cè)序分析共有6個(gè)讀碼框正確且位于CDS內(nèi)的基因片段,通過NCBI對(duì)基因序列片段進(jìn)行查找,全長(zhǎng)序列分別為 LOC100170728,MYB173,LOC100499708,LOC100306286,LOC100500540,LOC100038325。利用在線網(wǎng)站對(duì)得到的6個(gè)蛋白的基本信息及氨基酸序列進(jìn)行分析,通過PCR方法從大豆cDNA中成功得到5個(gè)基因片段的全長(zhǎng)序列,并成功構(gòu)建于PGADT7載體上,再次采用回轉(zhuǎn)驗(yàn)證的方法,將其分別與pGBKT7-PM18共轉(zhuǎn)至酵母菌中,結(jié)果顯示大豆LOC100170728和MYB173所編碼的蛋白與大豆抗鹽蛋白蛋白可能存在相互作用關(guān)系。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q946

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 孫楠;大豆抗鹽蛋白PM18互作蛋白的篩選及分析[D];深圳大學(xué);2017年

，

本文編號(hào)：1765590