本文選題：β-半乳糖苷酶　切入點：酶活力　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC3.2.1.23),簡稱乳糖酶(lactase),普遍存在于動物組織、植物及微生物中,具有將乳糖分解為半乳糖和葡萄糖的能力,并能夠催化產(chǎn)生半乳糖寡聚體,即低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS)。目前在食品工業(yè)和市場上,乳糖酶的這兩個酶反應(yīng)特性具有不同的實用意義。乳糖不耐癥是一個全球普遍存在的生理性問題,并且人們因為諸多原因都有可能從非乳糖不耐癥的群體發(fā)展成為乳糖不耐癥患者,因此無/低乳糖乳制品一直以來都受到特別的關(guān)注。另一方面,近年來國內(nèi)生活質(zhì)量的飛升,引起了多種相關(guān)疾病(肥胖、三高等)高發(fā),這些病種在國內(nèi)有上升趨勢,因此人們對膳食管理和食品安全倍加重視。研究表明GOS具有平衡腸道菌群,調(diào)節(jié)腸道酸堿度,預(yù)防便秘,改善人體腸道的生理功能,輔助鈣質(zhì)吸收,加速脂肪代謝,保護肝臟功能等多種特質(zhì),這使得GOS這種新型的天然食品添加劑有了廣闊的市場空間。而這些方向都是乳糖酶可能涉及的市場和工業(yè)領(lǐng)域。國內(nèi)對于乳糖酶耐高溫性質(zhì)和乳糖酶水解方向的研究較多,但對于GOS合成方向的研究剛剛起步。這些研究中,活性中心單個位點的氨基酸對整個乳糖酶雙向性質(zhì)影響的研究很少。國際上研究也比較少,只有少數(shù)科學(xué)家在做這方面相關(guān)的研究。因此在基于位點變化而影響乳糖酶分解能力或合成能力的研究上還有很大的空間。本研究通過點突變使β-半乳糖苷酶[Pyrococcus furiosus DSM 3638]415位天冬酰胺(Asn or N)突變?yōu)榻z氨酸(Ser or S),突變體構(gòu)建于巴斯德畢赤酵母表達質(zhì)粒載體,通過轉(zhuǎn)基因的方法把此線性化的重組質(zhì)粒整合入巴斯德畢赤酵母細胞中,經(jīng)藥物篩選獲取單克隆的細胞株,用以發(fā)酵表達進而制備β-半乳糖苷酶的突變體酶。研究結(jié)果表明,該突變體所產(chǎn)的β-半乳糖苷酶在95℃、pH=5.5時酶活力達到最高,為耐高溫乳糖酶;該乳糖酶的熱穩(wěn)定性良好,100℃加熱1h條件下,幾乎不影響該乳糖酶的活性;該突變體酶在低溫儲存環(huán)境下活性也十分穩(wěn)定;研究表明,該突變體酶水解牛奶的能力較好,可用于低乳糖牛奶及其相關(guān)制品加工中;突變后β-半乳糖苷酶的另一個方面的特性,即產(chǎn)生低聚半乳糖的能力的也有所提高,但不夠明顯,低于可工業(yè)化的水平。因此該突變株所產(chǎn)的乳糖酶可用于乳制品的加工行業(yè),但不能期盼產(chǎn)生更多的半乳糖寡聚體。同時研究通過中試級別乳糖酶生產(chǎn)發(fā)現(xiàn)該乳糖酶的表達活力隨菌體密度的增加而上升,這對于該菌株用于工業(yè)生產(chǎn)乳糖酶及后期純化十分有利。由研究可推測:源自Pyrococcus furiosus DSM 3638的乳糖酶基因耐熱程度較好。同時,位點氨基酸的改變影響了活性中心的構(gòu)象,從而在酶的穩(wěn)定性上得到了較大的提升。該突變位點所在活性中心可能更多的作用于水解乳糖的過程,但是對于GOS的合成并沒有太大的關(guān)聯(lián)。由此可進一步猜測,或許該耐熱乳糖酶合成GOS的能力另受其他位點的影響。
[Abstract]:Beta galactosidase (beta -galactosidase, EC3.2.1.23), (lactase), commonly referred to as lactase exists in animal tissues, plants and microorganisms, has ability to dissolve lactose galactose and glucose, and can produce galactose oligomers, i.e. galactooligosaccharides (Galactooligosaccharides, GOS). At present in food industry and market, has different practical significance of the two lactase enzyme reaction characteristics. Lactose intolerance is a universal psychological issue, and people for many reasons are likely from non lactose intolerance group become lactose intolerant, so no / low lactose dairy products have always attracted special attention. On the other hand, the quality of life of domestic soaring in recent years, due to a variety of related diseases (obesity, high incidence of these diseases, three higher) is on the rise in China, so people Pay attention to food management and food safety. More studies showed that GOS has the balance of intestinal flora, regulating intestinal pH, prevent constipation, improve the physiological function of the human intestinal tract, assisted calcium absorption, accelerate fat metabolism, protect liver function and other characteristics, which makes GOS the new natural food additive has a broad market space which direction is lactase may be involved in the market and industry. There are many researches on high temperature properties of lactase and lactase hydrolysis direction, but the study of GOS synthesis has just started. These studies, little effect of amino acid on the activity of a single center site. The two-way nature of lactase research relatively small, only a few scientists have done related research in this area. Based on site changes affect the lactase synthesis ability or capacity There is a lot of space research. The study of the beta galactosidase [Pyrococcus furiosus DSM 3638]415 (Asn or point mutation by asparagine to serine mutation (Ser N) or S), the mutant constructed Pasteur Pichia expression vector, through the method of transgenic recombinant plasmid to this linear integrated into Pasteur Pichia pastoris, the drug screening to obtain monoclonal cell lines with mutant enzyme preparation and expression of beta galactosidase in fermentation. The results showed that the mutants produced by beta galactosidase at 95 degrees, pH=5.5 enzyme activity reached the highest, the high-temperature thermal stability of the lactase; good 100 degrees of lactase, heating under the condition of 1H, almost does not affect the lactase activity; the mutant in the environment of low temperature storage activity is stable; research shows that the ability of the mutant enzyme hydrolysis of milk Well, can be used for low lactose milk and related products; on the other hand the characteristics of beta galactosidase mutation, produce oligomate ability is also improved, but obviously not enough, below the level of industrialization. Therefore the mutant strain produced by lactose enzyme can be used for dairy processing industry products, but cannot be expected to produce more galactose oligomers. At the same time through the research on the test level of lactase production showed that the expression of the lactase activity increased with increasing cell density, which for the strains used in industrial production and purification of lactase after period is very favorable. From the research that: from the good heat level of lactase gene Pyrococcus furiosus DSM 3638. At the same time, amino acid changes affecting the conformation of active center, thus greatly enhance the stability of the enzyme. The mutation site activity The heart may play more role in the hydrolysis of lactose, but it has little relationship with the synthesis of GOS. Further speculation is made that the ability of the thermostable lactase to synthesize GOS is also affected by other sites.

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q55;Q78

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本文編號：1716914