本文關(guān)鍵詞：豬傳染性胃腸炎病毒N基因的熒光定量PCR檢測方法建立及初步應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《四川農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2015年

豬傳染性胃腸炎病毒N基因的熒光定量PCR檢測方法建立及初步應(yīng)用

李蕊彤  

【摘要】：豬傳染性胃腸炎(TGE)是一種重要的仔豬病毒性腹瀉病。TGEV主要感染2周齡以內(nèi)的仔豬,引起嚴(yán)重的水樣腹瀉、嘔吐、脫水、死亡癥狀,死亡率達(dá)到100%。TGE的準(zhǔn)確診斷對防控該病非常重要。本研究以TGEV　N基因?yàn)榛A(chǔ),建立了檢測TGEV的熒光定量PCR方法,為該病的臨床診斷和疫苗含量監(jiān)控提供一種更準(zhǔn)確、靈敏的定量檢測方法。本研究根據(jù)TGEV分離株(SC-H株)的N基因設(shè)計了三對引物進(jìn)行PCR,擴(kuò)增的目的基因片段分別為236bp、186bp.236bpo擴(kuò)增目的基因與載體pMD-19(Simple)連接,再轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建重組質(zhì)粒。提取陽性重組質(zhì)粒pMD-N1、pMD-N2和pMD-N3,測定三種陽性質(zhì)粒的OD260值和OD280值,將OD260值換算成拷貝數(shù),并進(jìn)行PCR鑒定和測序。將重組質(zhì)粒以10倍梯度稀釋10個梯度以制備標(biāo)準(zhǔn)品,比較了三對引物的效果,選用第二對引物對應(yīng)的陽性質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR,建立TGEV N基因的SYBR Green-I實(shí)時熒光定量PCR法。優(yōu)化確定了退火溫度,最佳反應(yīng)程序,TGEV實(shí)時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)為0.996,擴(kuò)增效率為101.8%。該方法特異性好,PEDV、PoRV、PRRSV、CSFV、JEV無Ct值,均為陰性；具有良好的重復(fù)性,批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)5%；敏感性實(shí)驗(yàn)表明,該方法可測出的最低拷貝數(shù)為6.37×101拷貝/μL(常規(guī)PCR能夠檢測出的最低拷貝數(shù)為6.37×103拷貝/μL),靈敏度比常規(guī)PCR靈敏100倍。將建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行了應(yīng)用評價：1.臨床病料的檢測：收集來自四川彭州、蒲江、茂縣、攀枝花、樂山、綿陽、安岳、重慶涪陵、福建龍巖、山東肇東等地的臨床仔豬腹瀉病料80份,以該方法進(jìn)行檢測,并與常規(guī)PCR進(jìn)行比較,結(jié)果表明：普通PCR的結(jié)果是陽性病料8份,利用本實(shí)驗(yàn)建立的方法的結(jié)果是陽性病料15份,常規(guī)PCR檢測出的陽性樣品以熒光定量PCR檢測均為陽性。2.我國部分商品TGEV疫苗的病毒含量檢測：用該方法對基層可購買到的幾種商品TGEV疫苗進(jìn)行了隨機(jī)抽檢,測定病毒含量,結(jié)果表明：A公司的TGEV活疫苗含量較高,分別為：11089.35、7551.55、8041.59、12752.23、8097.97、9509.51、9916.58拷貝/μL;B、C、D公司的TGEV滅活疫苗含量非常少。本研究成功的建立了TGEVN基因SYBR Green-I實(shí)時熒光定量PCR法,能夠快速、準(zhǔn)確地對TGEV進(jìn)行定性和定量測定,為該病的準(zhǔn)確診斷、疫苗含量的監(jiān)測等提供了新的技術(shù)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.651
【目錄】：

下載全文 更多同類文獻(xiàn)

CAJ全文下載

(如何獲取全文？ 歡迎：購買知網(wǎng)充值卡、在線充值、在線咨詢)

CAJViewer閱讀器支持CAJ、PDF文件格式

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王劭;朱小麗;朱曉琳;陳少鶯;林鋒強(qiáng);陳仕龍;程曉霞;李兆龍;江斌;;豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)福建分離株核衣殼蛋白基因(N)的克隆與表達(dá)分析[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報;2013年01期

2 房紅瑩;竇守強(qiáng);羅滿林;;豬呼吸道冠狀病毒研究進(jìn)展[J];中國畜牧獸醫(yī)文摘;2007年06期

3 唐芳;何孔旺;侯繼波;姜平;;豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)S蛋白5'端基因重組腺病毒的構(gòu)建及其免疫特性[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報;2009年01期

4 房紅瑩;羅滿林;;豬傳染性胃腸炎病毒反向遺傳研究進(jìn)展[J];畜牧與獸醫(yī);2008年04期

5 ;Complete Genomic Sequence of Transmissible Gastroenteritis Virus TS and 3' End Sequence Characterization Following Cell Culture[J];Virologica Sinica;2010年03期

6 李建強(qiáng);柳紀(jì)省;程杰;蘭喜;殷相平;李寶玉;李學(xué)瑞;楊彬;婁忠子;吳潤;;豬源冠狀病毒TGEV中國分離株纖突蛋白生物信息學(xué)分析[J];生物技術(shù)通報;2009年04期

7 黃小波;鄧飛;曹三杰;文心田;楊恒;李春松;張鑫淼;張亮;;傳染性胃腸炎病毒(TGEV)雙啟動子真核表達(dá)載體pVAXD-N/S的構(gòu)建與鑒定[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報;2012年10期

8 ;Biological Characteristics and Etiological Significance of Porcine Respiratory Coronavirus(PRCV)[J];Journal of Northeast Agricultural University(English Edition);2009年02期

9 程杰,柳紀(jì)省,吳潤,殷相平;豬傳染性胃腸炎病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J];中國獸醫(yī)科技;2003年12期

10 丁利;陳光達(dá);許信剛;童德文;;豬傳染性胃腸炎病毒陜西株的分離鑒定[J];中國獸醫(yī)雜志;2011年10期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 鄒勇;周燕;王建超;華平;何錫忠;蘇萬國;唐永蘭;錢永清;;應(yīng)用微載體技術(shù)生產(chǎn)TGEV試驗(yàn)研究[A];第六屆全國會員代表大學(xué)暨第11次學(xué)術(shù)研討會論文集（下）[C];2005年

2 鄒勇;周燕;王建超;華平;何錫忠;蘇萬國;唐永蘭;錢永清;;應(yīng)用微載體技術(shù)生產(chǎn)TGEV試驗(yàn)研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第六屆全國會員代表大會暨第11次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2005年

3 ;Inhibition of porcine Transmissible gastroenteritis virus (TGEV) replication in mini-pigs by shRNA[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會暨中國免疫學(xué)會獸醫(yī)免疫分會第八次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

4 楊百亮;馮力;趙翠萍;孫東波;張建斌;;抗豬傳染性胃腸炎病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會暨中國免疫學(xué)會獸醫(yī)免疫分會第七次研討會論文集[C];2008年

5 周燕;王建超;華平;鄒勇;譚文松;;豬傳染性腸胃炎病毒(TGEV)在ST細(xì)胞中的增殖規(guī)律[A];第一屆全國化學(xué)工程與生物化工年會論文摘要集(下)[C];2004年

6 俞伏松;王劭;陳仕龍;程曉霞;黃梅清;江斌;邵良平;陳少鶯;;豬傳染性胃腸炎病毒福建株的分離與鑒定[A];2012年福建省畜牧獸醫(yī)學(xué)術(shù)年會論文集[C];2012年

7 李霞;張春紅;趙亞華;張建峰;;TGEV和PEDV多重RT-PCR檢測方法的建立及其細(xì)胞分離培養(yǎng)研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第四次豬病防控學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

8 黃小波;曹三杰;文心田;;豬傳染性胃腸炎病毒檢測基因芯片的初步構(gòu)建[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第六屆理事會第二次會議暨教學(xué)專業(yè)委員會第六屆代表大會論文集[C];2006年

9 黃小波;曹三杰;文心田;;豬傳染性胃腸炎病毒檢測基因芯片的初步構(gòu)建[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2006學(xué)術(shù)年會論文集（下冊）[C];2006年

10 李娜;黃小波;曹三杰;文心田;;豬傳染性胃腸炎病毒重組N蛋白單克隆抗體的制備及鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第三屆豬病防控學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 馬瑞麗;豬傳染性胃腸炎病毒感染ST細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

2 胡曉亮;豬傳染性胃腸炎病毒HX株的分離與鑒定及其PL蛋白對抗IFN-β的分子機(jī)制[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 蘭喜;豬傳染性胃腸炎病毒的分子診斷與免疫研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2006年

4 丁利;TGEV誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

5 安康;TGEV感染PK-15細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)及誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

6 王龍濤;豬傳染性胃腸炎病毒纖突蛋白基因體外克隆表達(dá)及鑒定[D];吉林大學(xué);2010年

7 彭樹英;TGEV S基因的克隆、表達(dá)及轉(zhuǎn)基因小鼠的制備[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年

8 楊恒;豬傳染性胃腸炎病毒DNA疫苗的構(gòu)建與免疫原性研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

9 周俊芳;shRNA表達(dá)載體抗豬傳染性胃腸炎病毒感染的研究[D];上海交通大學(xué);2007年

10 王承寶;TGE華毒強(qiáng)、弱毒株的全基因組分子差異及基于BAC反向遺傳系統(tǒng)的初探[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2010年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王雪;TGEV S-AD蛋白親和肽的篩選及鑒定[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

2 張清真;豬病毒性腹瀉病原ELISA及Luminex檢測方法研究[D];上海海洋大學(xué);2015年

3 徐靜;豬傳染性胃腸炎病毒分離及部分特性鑒定[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 王瑩瑩;嗜酸乳桿菌胞外多糖對TGEV感染ST細(xì)胞TLR3及部分細(xì)胞因子表達(dá)的影響[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 高睿澤;豬傳染性胃腸炎病毒RT-LAMP檢測方法的建立及初步應(yīng)用[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

6 田宗民;抑致病菌益生菌菌株及其胞外多糖抗TGEV作用的比較分析[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 杜彩虹;豬冠狀病毒性腹瀉RT-PCR檢測及豬傳染性胃腸炎病毒分離鑒定[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

8 李蕊彤;豬傳染性胃腸炎病毒N基因的熒光定量PCR檢測方法建立及初步應(yīng)用[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

9 魏浩澈;重組豬干擾素α抗豬傳染性胃腸炎病毒的研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

10 張莉娟;豬樹突狀細(xì)胞在豬傳染性胃腸炎病毒感染中的作用及機(jī)制研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：豬傳染性胃腸炎病毒N基因的熒光定量PCR檢測方法建立及初步應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。