本文關(guān)鍵詞：硫化物應(yīng)激下單環(huán)刺螠MAPK信號(hào)通路的功能初探，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國(guó)海洋大學(xué)》 2015年

硫化物應(yīng)激下單環(huán)刺螠MAPK信號(hào)通路的功能初探

劉樹人  

【摘要】：p38和ERK是MAPK信號(hào)通路中三條主要亞通路的關(guān)鍵分子,在生物體內(nèi)參與多種生命進(jìn)程,如細(xì)胞增殖、分化、黏附、存活、死亡、代謝以及應(yīng)對(duì)多種環(huán)境應(yīng)激等。目前大多數(shù)的相關(guān)研究都聚焦于哺乳動(dòng)物,并且在體外培養(yǎng)細(xì)胞中開展研究。海洋無(wú)脊椎動(dòng)物種類繁多,具有多樣的生理特征和生存環(huán)境,開展MAPK通路在低等動(dòng)物中的相關(guān)研究,將有助于人們系統(tǒng)認(rèn)知這些通路的生物學(xué)功能以及闡述其在動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境中的作用。單環(huán)刺螠(Urechis unicinctus)是一種棲息于沿岸底質(zhì)“U”形管道內(nèi)的螠蟲動(dòng)物,在退潮期間其洞穴內(nèi)的硫化物濃度通常明顯提高。之前的研究表明單環(huán)刺螠可以耐受這種硫化物的暴露,并且已在細(xì)胞學(xué)特征、代謝產(chǎn)物以及關(guān)鍵酶的作用等方面對(duì)這種現(xiàn)象進(jìn)行了解析。本文定位于MAPK信號(hào)通路,嘗試研究其在單環(huán)刺螠耐受硫化物過(guò)程中的作用,以期確定單環(huán)刺螠組織細(xì)胞中參與應(yīng)對(duì)硫化物的關(guān)鍵MAPK亞通路,為揭示單環(huán)刺螠耐受硫化物的分子機(jī)制提供科學(xué)數(shù)據(jù)。本研究取得的主要結(jié)果如下：采用RACE技術(shù)獲得了單環(huán)刺螠MAPK通路3個(gè)亞通路中的關(guān)鍵分子JNK、 p38和ERK的cDNA序列,其中JNKcDNA序列全長(zhǎng)為2102 bp,編碼403個(gè)氨基酸；p38 cDNA序列全長(zhǎng)為2772 bp,編碼363個(gè)氨基酸；ERK cDNA部分序列長(zhǎng)度為507 bp,可編碼169個(gè)氨基酸。將JNK、p38的ORF(開放閱讀框,open reading frame)全長(zhǎng)序列與pET28a載體連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,體外成功表達(dá)了包涵體形式的JNK、p38重組蛋白并獲得純度大于85%的純化蛋白,制備了它們的多克隆抗體。使用本次獲得JNK、p38多克隆抗體以及商業(yè)購(gòu)買的ERK多克隆體和3種蛋白的磷酸化單克隆抗體,采用Western blot技術(shù)研究了單環(huán)刺螠暴露在50μM和150 μM硫化物環(huán)境下,其呼吸腸細(xì)胞中上述3個(gè)關(guān)鍵分子總蛋白(非磷酸化蛋白,未活化型蛋白)含量和磷酸化蛋白(活化型蛋白)含量的變化,結(jié)果顯示：當(dāng)單環(huán)刺螠暴露于硫化物環(huán)境中時(shí),其呼吸腸細(xì)胞中磷酸化JNK的含量呈現(xiàn)顯著性地持續(xù)升高趨勢(shì),其起始顯著升高發(fā)生在單環(huán)刺螠暴露0.5 h,隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng),磷酸化JNK的含量持續(xù)升高,并在150μM硫化物暴露48 h時(shí)其含量增至最高,為對(duì)照組的10.2倍；此外,暴露于50μM硫化物中的單環(huán)刺螠呼吸腸磷酸化JNK含量普遍低于150μM硫化物相同暴露時(shí)間的磷酸化JNK的含量。單環(huán)刺螠呼吸腸中磷酸化ERK的含量在硫化物暴露0.25 h-1 h期間呈現(xiàn)瞬時(shí)顯著增高的特點(diǎn),之后其表達(dá)量與對(duì)照組以及不同濃度硫化物組間均無(wú)顯著性差異;單環(huán)刺螠呼吸腸中磷酸化p38的含量在整個(gè)硫化物暴露期間未見顯著性變化。單環(huán)刺螠硫化物暴露期間,JNK、p38在呼吸腸中的總蛋白含量均未見顯著性變化,除了p38總蛋白含量在暴露后0.25 h時(shí)顯著升高；ERK的總蛋白水平在150μM硫化物處理下呈現(xiàn)先降低后恢復(fù)原水平的變化,而在50μM硫化物處理組中則持續(xù)降低至原水平的35%后維持穩(wěn)定狀態(tài)。本研究結(jié)果表明,在MAPK通路的3個(gè)子通路中,JNK信號(hào)通路可能是單環(huán)刺螠應(yīng)對(duì)硫化物暴露的關(guān)鍵通路,ERK信號(hào)通路或許參與了單環(huán)刺螠早期應(yīng)對(duì)硫化物暴露的的過(guò)程,而p38在單環(huán)刺螠應(yīng)對(duì)硫化物暴露過(guò)程中作用不明顯。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q953
【目錄】：

摘要5-7

Abstract7-11

第一章 前言11-26

1 MAPK信號(hào)通路簡(jiǎn)介及其主要功能11-19

1.1 MAPK信號(hào)通路簡(jiǎn)介11-12

1.2 MAPKs家族蛋白的結(jié)構(gòu)及功能12-15

1.3 MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)亞通路及其功能15-19

2 硫化物的來(lái)源和在生物體內(nèi)的作用19-21

2.1 水體中外源硫化物的來(lái)源以及對(duì)生物的毒性19-20

2.2 內(nèi)源硫化物的合成和代謝以及其作用20-21

3 硫化氫與MAPK信號(hào)通路21-22

4 單環(huán)刺螠生物學(xué)特征及其耐受硫化物的研究進(jìn)展22-24

4.1 單環(huán)刺螠生物學(xué)特征22-23

4.2 單環(huán)刺螠硫化物耐受機(jī)制的相關(guān)研究23-24

5 論文研究意義24-26

第二章 單環(huán)刺螠MAPKs信號(hào)通路關(guān)鍵因子基因的克隆與生物信息學(xué)分析26-40

1 材料與方法26-33

1.1 材料26-27

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物26

1.1.2 試劑盒、工具酶和引物26-27

1.2 實(shí)驗(yàn)方法27-33

1.2.1 單環(huán)刺螠呼吸腸總RNA的提取27-28

1.2.1.1 實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備27

1.2.1.2 Trizol法提取RNA27-28

1.2.2 RACE擴(kuò)增JNK和p38的全長(zhǎng)序列28-31

1.2.3 部分ERK cDNA部分序列的獲取31-32

(1) 合成第一鏈cDNA31-32

1.2.4 ERK、JNK、p38的生物信息學(xué)分析32-33

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-38

2.1 單環(huán)刺螠JNK全長(zhǎng)cDNA序列的獲得和特征分析33-35

2.2 單環(huán)刺螠p38全長(zhǎng)cDNA序列的獲得和特征分析35-36

2.3 單環(huán)刺螠ERK的序列特征分析36-38

3 討論38-40

第三章 單環(huán)刺螠硫化物應(yīng)激下MAPKs通路的反應(yīng)40-57

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法41-49

1.1 實(shí)驗(yàn)材料41-42

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣本制備41

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料41-42

1.2 實(shí)驗(yàn)方法42-49

1.2.1 單環(huán)刺螠JNK、p38原核表達(dá)載體的構(gòu)建42-44

1.2.2 單環(huán)刺螠JNK和p38重組蛋白的原核表達(dá)44-45

1.2.3 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化45

1.2.4 目的重組包涵體蛋白的純化45

1.2.5 JNK和p38多克隆抗體的制備和效價(jià)檢測(cè)45-46

1.2.6 多克隆抗體的特異性檢測(cè)46-47

1.2.7 JNK、p38、ERK磷酸化單克隆抗體的選擇及購(gòu)買47

1.2.8 Western blot檢測(cè)47-48

1.2.9 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理48-49

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果49-54

2.1 目的基因體外重組蛋白的表達(dá)和純化49-50

2.2 多克隆抗體的效價(jià)和特異性檢測(cè)50-51

2.3 JNK在硫化物暴露下的單環(huán)刺螠呼吸腸細(xì)胞中被長(zhǎng)效激活51-52

2.4 p38在單環(huán)刺螠硫化物暴露下的呼吸腸細(xì)胞中表達(dá)量瞬間升高52-53

2.5 ERK在單環(huán)刺螠硫化物暴露下的呼吸腸細(xì)胞中被瞬時(shí)激活53-54

3 討論54-57

3.1 JNK信號(hào)通路是單環(huán)刺螠呼吸腸應(yīng)對(duì)硫化物暴露的主要MAPKs通路55

3.2 ERK的瞬時(shí)激活可能與細(xì)胞存活相關(guān)55-56

3.3 JNK和ERK信號(hào)通路之間的平衡決定細(xì)胞的命運(yùn)56-57

結(jié)論57-58

參考文獻(xiàn)58-68

致謝68-69

個(gè)人簡(jiǎn)歷69

發(fā)表的學(xué)術(shù)論文69

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本文編號(hào)：165126