本文選題：紫花椰菜　切入點(diǎn)：煙草　出處：《西南大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：花青素是一類黃酮類化合物,對(duì)植物生長(zhǎng)和動(dòng)物健康都具有積極的意義。對(duì)于植物本身而言,花青素賦予植物營(yíng)養(yǎng)器官、生殖器官等鮮艷的顏色,避免植物細(xì)胞受到病害、光照、氧化性的傷害,延長(zhǎng)果品貨架期及增加植物對(duì)逆境條件的適應(yīng)能力等。花青素作為一種天然食用色素,安全、無(wú)毒、資源豐富,而且具有一定營(yíng)養(yǎng)和藥理作用,在食品、化妝、醫(yī)藥方面有著巨大應(yīng)用潛力。近年來(lái),調(diào)控植物花青素合成途徑的分子機(jī)制越來(lái)越明晰。其中MYB、bHLH和WD40這三類轉(zhuǎn)錄因子所組成的MBW(MYB-bHLH-WD40)轉(zhuǎn)錄復(fù)合體被廣泛證明卷入了花青素合成調(diào)控。鑒于來(lái)自不同物種的轉(zhuǎn)錄因子異源表達(dá)后常表現(xiàn)出與原植物中不同的花青素調(diào)控模式,且這三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子如何在異源植物中協(xié)同調(diào)控花青素的合成機(jī)制仍不清楚。因此,本研究從紫色花椰菜中分離三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子BoMYB2、BoTT8和BoTTG1在35S啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下在煙草中單獨(dú)或共表達(dá),比較其形態(tài)學(xué)特征、花青素積累模式以及花青素合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),揭示了三個(gè)基因在煙草花青素積累中的功能和作用。本研究中獲得主要結(jié)果如下:1.提取紫花菜品種Graffiti花球總RNA,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,根據(jù)Genbank公布的GU219986,GU219990以及GU21999序列信息,設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異引物。從cDNA中分別分離到744bp BoMYB2基因,1566bp BoTT8基因,1014bp BoTTG1基因。經(jīng)核苷酸序列、氨基酸序列比較、進(jìn)化樹分析,顯示獲得的基因?yàn)檎{(diào)控花青素合成的三個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子。2.構(gòu)建了以Bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的植物表達(dá)載體35Spro:MYB2、35Spro:TT8和35Spro:MYB2TT8以及Hpt基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的35Spro:TTG1的植物表達(dá)載體。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的單獨(dú)葉盤轉(zhuǎn)化或者共轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入普通煙草,分別獲得35Spro:MYB2,35Spro:TT8和35Spro:TTG1三個(gè)單轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)植株;35Spro:MYB2TT8,35Spro:MYB2TTG1和35Spro:TT8TTG1三個(gè)雙轉(zhuǎn)錄因子共表達(dá)植株;一個(gè)35Spro:MYB2TT8TTG1三轉(zhuǎn)錄因子共表達(dá)植株。35Spro:TT8,35Spro:TTG1以及35Spro:TT8TTG1轉(zhuǎn)基因在愈傷組織、根系及嫩葉中均未見(jiàn)花青素積累。而所有表達(dá)BoMYB2轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因煙草,其愈傷組織、根系及嫩葉中均可見(jiàn)花青素積累,其中35Spro:MYB2TT8和35Spro:MYB2TT8TTG1的愈傷組織、根、莖、葉均呈紫色,花青素積累量更高。針對(duì)花青素合成途徑的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)分析顯示,所有基因型的轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的EBGs表達(dá)量與野生型間無(wú)較大的差異,而積累花青素的35Spro:MYB2、35Spro:MYB2TTG1、35Spro:MYB2TT8基因型的轉(zhuǎn)基因煙草葉片的LBGs(NtF3Ha,Nt DFR和NtANS)的表達(dá)量明顯高于野生型、35Spro:TT8、35Spro:TTG1及35Spro:TT8TTG1植株。顯示BoMYB2轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控花青素合成的關(guān)鍵因子。3.凡表達(dá)BoMYB2基因的轉(zhuǎn)基因植株的花器官中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的色素積累。盡管35Spro:TT8和35Spro:TT8TTG1轉(zhuǎn)基因煙草植株在營(yíng)養(yǎng)器官無(wú)花青素積累,但在花器官中可見(jiàn)明顯的花色素積累。針對(duì)花青素合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),所有基因型的轉(zhuǎn)基因植株EBGs的表達(dá)沒(méi)有差異,而LBGs(NtDFR和NtANS)的表達(dá)量得到上調(diào)。表明BoTT8轉(zhuǎn)錄因子能單獨(dú)調(diào)控花器官中花青素的積累。4.在種子發(fā)芽以及苗期階段,轉(zhuǎn)錄因子BoTT8和BoTTG1不影響花青素的合成和積累。BoMYB2單獨(dú)表達(dá)促進(jìn)花青素在種子發(fā)芽后的子葉以及幼嫩的真葉中積累。但BoMYB2和BoTTG1共表達(dá)后抑制花青素在發(fā)芽的子葉中積累而促進(jìn)其在幼嫩的真葉中積累。BoMYB2和BoTT8共表達(dá),BoMYB2、BoTT8和BoTTG1共表達(dá)均導(dǎo)致花青素在萌發(fā)后的子葉、胚軸、根尖、幼苗真葉中大量積累。5.比較轉(zhuǎn)基因植株的T1種子萌發(fā)后的根系結(jié)果顯示,BoTTG1基因型T1代植株的根系長(zhǎng)于野生型,而BoTT8和BoTT8TTG1基因型T1代植株的根系短于BoTTG1基因型和野生型,BoMYB2、BoMYB2TTG1的T1代根系長(zhǎng)度也明顯短于野生型。而共表達(dá)BoMYB2和BoTT8以及共表達(dá)BoMYB2,BoTT8和BoTTG1轉(zhuǎn)基因的T1代植株根系的長(zhǎng)度最短。以上結(jié)果表明異源表達(dá)BoTTG1轉(zhuǎn)錄因子對(duì)根系的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用,而BoTT8和BoMYB2對(duì)根系的生長(zhǎng)具有抑制作用。
[Abstract]:Anthocyanins are a class of flavonoids, have positive effect on plant growth and animal health. The plant itself, anthocyanins give the nutritive organs, reproductive organs and other bright colors, avoid plant cells by disease, light, oxidative damage, prolong the shelf life of fruit plants and increase the ability to adapt to stress conditions. Anthocyanin as a natural pigment, safe, non-toxic, rich in resources, but also has certain nutritional and pharmacological effects in food, cosmetic, has great potential applications in medicine. In recent years, the molecular mechanism underlying plant anthocyanin synthesis pathway is more and more clear. The MYB, bHLH and WD40 of these three kinds of transcription factors the composition of MBW (MYB-bHLH-WD40) transcription complex is widely shown involved in anthocyanin synthesis regulation. In view of the fact that from different species of heterologous transcription factor after show with the original The regulation of anthocyanin different patterns of plants, the synthesis mechanism and how these three transcription factors in heterologous plants co regulation of anthocyanin remains unclear. Therefore, the separation of three transcription factor BoMYB2 from purple broccoli, BoTT8 and BoTTG1 under the control of 35S promoter in tobacco alone or co expression, comparison the morphological characteristics, expression of anthocyanin accumulation pattern and anthocyanin synthesis gene structure, revealing the function and role of three genes in anthocyanin accumulation in tobacco. The main results obtained in this study are as follows: 1. the extraction of vegetable varieties Graffiti curd total RNA by reverse transcription cDNA, according to Genbank released GU219986, GU219990 and GU21999 sequence information, design the corresponding specific primers. CDNA were isolated from 744bp BoMYB2 1566bp gene, BoTT8 gene, 1014bp BoTTG1 gene. The nucleotide sequence and amino acid sequence A, phylogenetic analysis, display constructed using Bar gene as a selection marker of the plant expression vector 35Spro:MYB2,35Spro:TT8 and 35Spro:MYB2TT8 and Hpt gene as selection marker 35Spro:TTG1 plant expression vector obtained gene into three important transcription factor.2. regulates anthocyanin synthesis. Separate transformed by Agrobacterium mediated leaf disc transformation method or the total the import of tobacco, respectively 35Spro:MYB2,35Spro:TT8 and 35Spro:TTG1 three single plant transcription factor expression; 35Spro:MYB2TT8,35Spro:MYB2TTG1 and 35Spro:TT8TTG1 three double co expression of transcription factor.35Spro:TT8,35Spro:TTG1 and 35Spro:TT8TTG1 transgenic plants; plants in callus co expression of a 35Spro:MYB2TT8TTG1 transcription factor three, the accumulation of root and leaves had no anthocyanin. All expression of transcription factor BoMYB2 gene tobacco, callus, root The leaves are visible in anthocyanin accumulation and 35Spro:MYB2TT8 and 35Spro:MYB2TT8TTG1, callus, root, stem and leaf were purple anthocyanin accumulation. Higher expression of structural genes in the anthocyanin synthesis pathway analysis showed that transgenic tobacco leaves of all genotypes in the EBGs expression has no significant difference between the wild type and quantity that transgenic tobacco leaves 35Spro:MYB2,35Spro:MYB2TTG1,35Spro:MYB2TT8 genotype and anthocyanin accumulation of LBGs (NtF3Ha, Nt, DFR and NtANS) expression was significantly higher than that of the wild type, 35Spro:TT8,35Spro:TTG1 and 35Spro:TT8TTG1 display plants. BoMYB2 transcription factor shows a strong accumulation of pigment.3. key factor in regulating the anthocyanin synthesis and expression of BoMYB2 gene in the transgenic plants in floral organs although 35Spro:TT8 and 35Spro:TT8TTG1 transgenic tobacco plants in vegetative organs but no anthocyanin accumulation. The accumulation of anthocyanin was observed in floral organs. According to the structural genes involved in anthocyanin synthesis and expression analysis found that there is no difference between the expression of EBGs in transgenic plants of all genotypes, and LBGs (NtDFR and NtANS) expression were gained. The results indicated that BoTT8 transcription factor can control single flower anthocyanin accumulation in.4. seed germination and seedling stage, transcription factor BoTT8 and BoTTG1 do not affect the synthesis and accumulation of anthocyanin.BoMYB2 alone increased expression of anthocyanin accumulation in the cotyledons after seed germination and young leaf. But the BoMYB2 and BoTTG1 co expression inhibited anthocyanin accumulation in germinating cotyledons and promote it in young leaf and the accumulation of.BoMYB2 Co expression of BoTT8, BoMYB2, BoTT8 and BoTTG1 co expression resulted in anthocyanin after germination of cotyledon, hypocotyl and root, the accumulation of.5. in leaves of transgenic seedlings T1 after the seed germination root showed that the BoTTG1 genotype of T1 generation plants roots longer than wild type, while BoTT8 and BoTT8TTG1 genotypes of T1 generations were root shorter than BoTTG1 genotype and the wild type, BoMYB2, length T1 generation root BoMYB2TTG1 was significantly shorter than that of wild type. The co expression of BoMYB2 and BoTT8 and co the expression of BoMYB2, BoTT8 and BoTTG1 transgenic T1 generation plant root length is the shortest. The results above showed that heterologous expression can promote the growth of BoTTG1 transcription factor in root, while BoTT8 and BoMYB2 can inhibit the growth of roots.

【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q946;Q943.2

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