本文選題：紫花椰菜　切入點：煙草　出處：《西南大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：花青素是一類黃酮類化合物,對植物生長和動物健康都具有積極的意義。對于植物本身而言,花青素賦予植物營養(yǎng)器官、生殖器官等鮮艷的顏色,避免植物細胞受到病害、光照、氧化性的傷害,延長果品貨架期及增加植物對逆境條件的適應能力等�；ㄇ嗨刈鳛橐环N天然食用色素,安全、無毒、資源豐富,而且具有一定營養(yǎng)和藥理作用,在食品、化妝、醫(yī)藥方面有著巨大應用潛力。近年來,調(diào)控植物花青素合成途徑的分子機制越來越明晰。其中MYB、bHLH和WD40這三類轉(zhuǎn)錄因子所組成的MBW(MYB-bHLH-WD40)轉(zhuǎn)錄復合體被廣泛證明卷入了花青素合成調(diào)控。鑒于來自不同物種的轉(zhuǎn)錄因子異源表達后常表現(xiàn)出與原植物中不同的花青素調(diào)控模式,且這三個轉(zhuǎn)錄因子如何在異源植物中協(xié)同調(diào)控花青素的合成機制仍不清楚。因此,本研究從紫色花椰菜中分離三個轉(zhuǎn)錄因子BoMYB2、BoTT8和BoTTG1在35S啟動子的驅(qū)動下在煙草中單獨或共表達,比較其形態(tài)學特征、花青素積累模式以及花青素合成結構基因的表達,揭示了三個基因在煙草花青素積累中的功能和作用。本研究中獲得主要結果如下:1.提取紫花菜品種Graffiti花球總RNA,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,根據(jù)Genbank公布的GU219986,GU219990以及GU21999序列信息,設計相應的特異引物。從cDNA中分別分離到744bp BoMYB2基因,1566bp BoTT8基因,1014bp BoTTG1基因。經(jīng)核苷酸序列、氨基酸序列比較、進化樹分析,顯示獲得的基因為調(diào)控花青素合成的三個重要轉(zhuǎn)錄因子。2.構建了以Bar基因為篩選標記的植物表達載體35Spro:MYB2、35Spro:TT8和35Spro:MYB2TT8以及Hpt基因為篩選標記的35Spro:TTG1的植物表達載體。通過農(nóng)桿菌介導的單獨葉盤轉(zhuǎn)化或者共轉(zhuǎn)化法將其導入普通煙草,分別獲得35Spro:MYB2,35Spro:TT8和35Spro:TTG1三個單轉(zhuǎn)錄因子表達植株;35Spro:MYB2TT8,35Spro:MYB2TTG1和35Spro:TT8TTG1三個雙轉(zhuǎn)錄因子共表達植株;一個35Spro:MYB2TT8TTG1三轉(zhuǎn)錄因子共表達植株。35Spro:TT8,35Spro:TTG1以及35Spro:TT8TTG1轉(zhuǎn)基因在愈傷組織、根系及嫩葉中均未見花青素積累。而所有表達BoMYB2轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因煙草,其愈傷組織、根系及嫩葉中均可見花青素積累,其中35Spro:MYB2TT8和35Spro:MYB2TT8TTG1的愈傷組織、根、莖、葉均呈紫色,花青素積累量更高。針對花青素合成途徑的結構基因的表達分析顯示,所有基因型的轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的EBGs表達量與野生型間無較大的差異,而積累花青素的35Spro:MYB2、35Spro:MYB2TTG1、35Spro:MYB2TT8基因型的轉(zhuǎn)基因煙草葉片的LBGs(NtF3Ha,Nt DFR和NtANS)的表達量明顯高于野生型、35Spro:TT8、35Spro:TTG1及35Spro:TT8TTG1植株。顯示BoMYB2轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控花青素合成的關鍵因子。3.凡表達BoMYB2基因的轉(zhuǎn)基因植株的花器官中表現(xiàn)出強烈的色素積累。盡管35Spro:TT8和35Spro:TT8TTG1轉(zhuǎn)基因煙草植株在營養(yǎng)器官無花青素積累,但在花器官中可見明顯的花色素積累。針對花青素合成途徑中的結構基因表達分析發(fā)現(xiàn),所有基因型的轉(zhuǎn)基因植株EBGs的表達沒有差異,而LBGs(NtDFR和NtANS)的表達量得到上調(diào)。表明BoTT8轉(zhuǎn)錄因子能單獨調(diào)控花器官中花青素的積累。4.在種子發(fā)芽以及苗期階段,轉(zhuǎn)錄因子BoTT8和BoTTG1不影響花青素的合成和積累。BoMYB2單獨表達促進花青素在種子發(fā)芽后的子葉以及幼嫩的真葉中積累。但BoMYB2和BoTTG1共表達后抑制花青素在發(fā)芽的子葉中積累而促進其在幼嫩的真葉中積累。BoMYB2和BoTT8共表達,BoMYB2、BoTT8和BoTTG1共表達均導致花青素在萌發(fā)后的子葉、胚軸、根尖、幼苗真葉中大量積累。5.比較轉(zhuǎn)基因植株的T1種子萌發(fā)后的根系結果顯示,BoTTG1基因型T1代植株的根系長于野生型,而BoTT8和BoTT8TTG1基因型T1代植株的根系短于BoTTG1基因型和野生型,BoMYB2、BoMYB2TTG1的T1代根系長度也明顯短于野生型。而共表達BoMYB2和BoTT8以及共表達BoMYB2,BoTT8和BoTTG1轉(zhuǎn)基因的T1代植株根系的長度最短。以上結果表明異源表達BoTTG1轉(zhuǎn)錄因子對根系的生長具有促進作用,而BoTT8和BoMYB2對根系的生長具有抑制作用。
[Abstract]:Anthocyanins are a class of flavonoids, have positive effect on plant growth and animal health. The plant itself, anthocyanins give the nutritive organs, reproductive organs and other bright colors, avoid plant cells by disease, light, oxidative damage, prolong the shelf life of fruit plants and increase the ability to adapt to stress conditions. Anthocyanin as a natural pigment, safe, non-toxic, rich in resources, but also has certain nutritional and pharmacological effects in food, cosmetic, has great potential applications in medicine. In recent years, the molecular mechanism underlying plant anthocyanin synthesis pathway is more and more clear. The MYB, bHLH and WD40 of these three kinds of transcription factors the composition of MBW (MYB-bHLH-WD40) transcription complex is widely shown involved in anthocyanin synthesis regulation. In view of the fact that from different species of heterologous transcription factor after show with the original The regulation of anthocyanin different patterns of plants, the synthesis mechanism and how these three transcription factors in heterologous plants co regulation of anthocyanin remains unclear. Therefore, the separation of three transcription factor BoMYB2 from purple broccoli, BoTT8 and BoTTG1 under the control of 35S promoter in tobacco alone or co expression, comparison the morphological characteristics, expression of anthocyanin accumulation pattern and anthocyanin synthesis gene structure, revealing the function and role of three genes in anthocyanin accumulation in tobacco. The main results obtained in this study are as follows: 1. the extraction of vegetable varieties Graffiti curd total RNA by reverse transcription cDNA, according to Genbank released GU219986, GU219990 and GU21999 sequence information, design the corresponding specific primers. CDNA were isolated from 744bp BoMYB2 1566bp gene, BoTT8 gene, 1014bp BoTTG1 gene. The nucleotide sequence and amino acid sequence A, phylogenetic analysis, display constructed using Bar gene as a selection marker of the plant expression vector 35Spro:MYB2,35Spro:TT8 and 35Spro:MYB2TT8 and Hpt gene as selection marker 35Spro:TTG1 plant expression vector obtained gene into three important transcription factor.2. regulates anthocyanin synthesis. Separate transformed by Agrobacterium mediated leaf disc transformation method or the total the import of tobacco, respectively 35Spro:MYB2,35Spro:TT8 and 35Spro:TTG1 three single plant transcription factor expression; 35Spro:MYB2TT8,35Spro:MYB2TTG1 and 35Spro:TT8TTG1 three double co expression of transcription factor.35Spro:TT8,35Spro:TTG1 and 35Spro:TT8TTG1 transgenic plants; plants in callus co expression of a 35Spro:MYB2TT8TTG1 transcription factor three, the accumulation of root and leaves had no anthocyanin. All expression of transcription factor BoMYB2 gene tobacco, callus, root The leaves are visible in anthocyanin accumulation and 35Spro:MYB2TT8 and 35Spro:MYB2TT8TTG1, callus, root, stem and leaf were purple anthocyanin accumulation. Higher expression of structural genes in the anthocyanin synthesis pathway analysis showed that transgenic tobacco leaves of all genotypes in the EBGs expression has no significant difference between the wild type and quantity that transgenic tobacco leaves 35Spro:MYB2,35Spro:MYB2TTG1,35Spro:MYB2TT8 genotype and anthocyanin accumulation of LBGs (NtF3Ha, Nt, DFR and NtANS) expression was significantly higher than that of the wild type, 35Spro:TT8,35Spro:TTG1 and 35Spro:TT8TTG1 display plants. BoMYB2 transcription factor shows a strong accumulation of pigment.3. key factor in regulating the anthocyanin synthesis and expression of BoMYB2 gene in the transgenic plants in floral organs although 35Spro:TT8 and 35Spro:TT8TTG1 transgenic tobacco plants in vegetative organs but no anthocyanin accumulation. The accumulation of anthocyanin was observed in floral organs. According to the structural genes involved in anthocyanin synthesis and expression analysis found that there is no difference between the expression of EBGs in transgenic plants of all genotypes, and LBGs (NtDFR and NtANS) expression were gained. The results indicated that BoTT8 transcription factor can control single flower anthocyanin accumulation in.4. seed germination and seedling stage, transcription factor BoTT8 and BoTTG1 do not affect the synthesis and accumulation of anthocyanin.BoMYB2 alone increased expression of anthocyanin accumulation in the cotyledons after seed germination and young leaf. But the BoMYB2 and BoTTG1 co expression inhibited anthocyanin accumulation in germinating cotyledons and promote it in young leaf and the accumulation of.BoMYB2 Co expression of BoTT8, BoMYB2, BoTT8 and BoTTG1 co expression resulted in anthocyanin after germination of cotyledon, hypocotyl and root, the accumulation of.5. in leaves of transgenic seedlings T1 after the seed germination root showed that the BoTTG1 genotype of T1 generation plants roots longer than wild type, while BoTT8 and BoTT8TTG1 genotypes of T1 generations were root shorter than BoTTG1 genotype and the wild type, BoMYB2, length T1 generation root BoMYB2TTG1 was significantly shorter than that of wild type. The co expression of BoMYB2 and BoTT8 and co the expression of BoMYB2, BoTT8 and BoTTG1 transgenic T1 generation plant root length is the shortest. The results above showed that heterologous expression can promote the growth of BoTTG1 transcription factor in root, while BoTT8 and BoMYB2 can inhibit the growth of roots.

【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q946;Q943.2

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