本文選題：TBC1D15　切入點(diǎn)：條紋斑竹鯊　出處：《浙江理工大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：TBC結(jié)構(gòu)域(Rab-GAP)是一段約由200個(gè)氨基酸殘基組成的高度保守的氨基酸序列,幾乎所有真核生物都含有TBC結(jié)構(gòu)域的蛋白。TBC1D15(TBC1 domain family member15)作為含TBC結(jié)構(gòu)域大家族的其中一員,參與多種生理功能,對生物體具有重要的調(diào)控作用。根據(jù)現(xiàn)有的研究表明,TBC1D15是一種高度保守的蛋白,具有GTP酶激活蛋白活性,同時(shí)對Rab7也具有明顯的底物偏愛性。TBC1D15能通過調(diào)節(jié)Rab7進(jìn)而來調(diào)節(jié)溶酶體的形態(tài),此外,它在維持生長因子依賴性上同樣具有重要的作用。條紋斑竹鯊TBC1D15最早是在其肝臟中發(fā)現(xiàn)的,其基因序列包含有4213個(gè)堿基對。另外,條紋斑竹鯊TBC1D15的N端具有APSL(鯊肝活性肽)結(jié)構(gòu)域,此結(jié)構(gòu)域與條紋斑竹鯊肝臟再生有關(guān),能夠降低2型糖尿病小鼠的血糖水平,另外還具有顯著的免疫調(diào)節(jié)和抑制脂質(zhì)體氧化的作用。本課題組通過體外酶促反應(yīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),條紋斑竹鯊TBC1D15對Rab7a具有GTP酶激活蛋白活性。盡管我們已經(jīng)通過體外實(shí)驗(yàn),測定了條紋斑竹鯊TBC1D15的GAP活性,但是對于這一催化機(jī)制還尚未清楚。到目前為止,也沒有TBC1D15的結(jié)構(gòu)模型來幫助我們解釋這一機(jī)制,因此希望利用晶體學(xué)的方法來解析條紋斑竹鯊TBC1D15的蛋白結(jié)構(gòu)以及其與作用蛋白Rab的復(fù)合結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)全長的TBC1D15(條紋斑竹鯊Shark、人Homo、豬Sus、鼠Mus)蛋白序列,利用生物信息學(xué)的方法分析Rab-GAP的二級結(jié)構(gòu),并對這四種蛋白分別設(shè)計(jì)4個(gè)不同的截短,通過蛋白的表達(dá)、純化和HPLC鑒定,篩選出性狀最優(yōu)的蛋白。之后通過蛋白的結(jié)晶實(shí)驗(yàn),初步篩選出適宜的蛋白結(jié)晶條件,再根據(jù)蛋白結(jié)晶條件的優(yōu)化,得到高分辨的蛋白晶體。結(jié)果表明,Sus GAP-2、Shark GAP-2、Homo GAP-2以及Mus GAP-2均具有很好的表達(dá)性質(zhì),通過蛋白結(jié)晶實(shí)驗(yàn),獲得Shark GAP-2和Sus GAP-2這兩種蛋白晶體。通過后續(xù)的蛋白結(jié)晶條件優(yōu)化、數(shù)據(jù)收集和結(jié)構(gòu)解析工作,得到了分辨率分別為2.8?(Shark GAP-2)和2.5?(Sus GAP-2)的晶體結(jié)構(gòu)。將這兩個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)極其相似,這也證明了TBC1D15在進(jìn)化上的高度保守性。另外,與酵母Gyp1p和TBC1D1的結(jié)構(gòu)比較中發(fā)現(xiàn),盡管它們都是由16個(gè)α螺旋組成,沒有β折疊結(jié)構(gòu),但還是有很多結(jié)構(gòu)上的差異,這說明了我們分離、純化,解析得到的Shark GAP-2和Sus GAP-2晶體結(jié)構(gòu),是全新的蛋白結(jié)構(gòu),這也是對TBC家族蛋白結(jié)構(gòu)的補(bǔ)充。另外,以Rab11a和Rab7a作為底物,對Shark GAP-2和Sus GAP-2進(jìn)行體外GAP(GTPase-activating protein)活性測定。結(jié)果表明,這兩種蛋白均能夠加速Rab11a和Rab7a水解GTP形成GDP。基于Shark GAP-2和Sus GAP-2的蛋白結(jié)構(gòu),對Shark GAP-2和Sus GAP-2催化motif上的精氨酸和谷氨酰胺分別設(shè)計(jì)突變:Shark GAP-2(R437A、R437K、Q474A)和Sus GAP-2(R400A、R400K、Q437A)。對這一系列突變蛋白進(jìn)行GAP體外活性測定,發(fā)現(xiàn)突變后的蛋白活性喪失。這證明了催化motif上的精氨酸和谷氨酰胺是關(guān)鍵的催化氨基酸,其任意一個(gè)突變都將導(dǎo)致GAP活性的喪失。最后,嘗試將Shark GAP-2和Sus GAP-2分別與Rab7a和Rab11a進(jìn)行共表達(dá)和串聯(lián)表達(dá),以此來得到GAP蛋白與Rab底物蛋白的復(fù)合結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,共表達(dá)方法并不能夠得到想要的蛋白,而串聯(lián)表達(dá)可以獲得。對串聯(lián)表達(dá)的蛋白(Shark1215+3GSA+Rab7a/Rab11a、Sus2010+3GSA+Rab7a/Rab11a)嘗試進(jìn)行結(jié)晶實(shí)驗(yàn),但均未得到蛋白晶體。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q51

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本文編號：1618022