本文關(guān)鍵詞： 呼吸道合胞病毒 融合蛋白F 納米顆粒 流感病毒載體 免疫效果評價　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：呼吸道合胞病毒(RSV)是引起嬰幼兒、老年人及免疫功能缺陷患者下呼吸道感染的重要病原體。據(jù)報道,全球每年5歲以下兒童感染RSV人數(shù)達3,300萬,死亡人數(shù)約為16萬人。RSV的復(fù)感率高,2歲以下兒童超過90%至少感染過一次RSV,其中70%患者發(fā)生住院感染且并發(fā)細支氣管炎、肺炎及哮喘,老年人常導(dǎo)致阻塞性肺病且伴有心肺并發(fā)癥。RSV每年造成巨大的經(jīng)濟損失,并嚴重威脅人類健康,而研制RSV疫苗的工作自上世紀60年代開展至今,仍沒有認證的有效疫苗上市。因此,WHO將RSV疫苗的研制列為急迫解決的問題之一。1960年,應(yīng)用福爾馬林滅活病毒后制備的FI-RSV疫苗應(yīng)用于臨床,其不但沒有起到防控作用,反而引起免疫增強性疾病(ERD)從而導(dǎo)致2名患嬰死亡。隨后出現(xiàn)利用傳統(tǒng)方法研制的多種RSV疫苗,雖然取得一定的成效,但大多止步于臨床試驗。亞單位疫苗被認為是最有可能發(fā)展為預(yù)防老年人感染RSV的疫苗,而減毒活疫苗是最有可能成為預(yù)防嬰幼兒感染RSV的候選疫苗株。許多國際前沿研究對這兩種疫苗形式也有很多探索。Qing Yan等人從臨床標本分離采用連續(xù)傳代方法篩選制備冷適應(yīng)KM516-AS疫苗,但存在毒力返祖現(xiàn)象而未批準臨床試驗。Jin和Ruth等人采用反向遺傳學(xué)、基因重組技術(shù)分別研制出rA2DM2-2及rA2cp248/404/1030ΔSH疫苗,Ⅰ期臨床研究結(jié)果表現(xiàn)出良好的免疫原性及保護性,但因減毒不夠或減毒過度等問題存在安全隱患。MedImmune、Novatis等研制的F蛋白亞單位疫苗(PFP)臨床研究,Ⅰ期實驗證實PFP用于健康成人、12個月以上的兒童和孕婦是安全的,具有免疫原性,但疫苗并沒有完全解決偏向Th2免疫應(yīng)答的問題,仍存在易引起免疫過激等安全性問題。因此,著力研制亞單位疫苗和減毒活疫苗,對RSV疾病的防治具有深遠意義。選擇優(yōu)勢的保護性抗原對RSV疫苗的制備至關(guān)重要。F蛋白是RSV病毒主要保護性抗原,具有高度的保守性,F蛋白被單克隆抗體作為識別靶點,現(xiàn)今大多數(shù)進入臨床試驗的RSV候選疫苗多選擇F蛋白作為抗原靶標,在疫苗研究中應(yīng)用廣泛。近年來,將納米技術(shù)應(yīng)用于疫苗研究是近年來的熱點,也被估計具有一千多億的市場價值。無論是通過納米顆粒自身激活或強化免疫,還是作為投遞系統(tǒng)或免疫刺激佐劑增強免疫應(yīng)答,都得到了廣泛的探索和應(yīng)用。預(yù)示著納米顆粒有望使疾病的治療和生物活性組分的遞送發(fā)生革命性的變革。針對免疫途徑的選擇,鼻腔免疫所需的疫苗量和佐劑量較小,能夠激發(fā)機體產(chǎn)生粘膜免疫應(yīng)答后誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫應(yīng)答。同時,減毒活疫苗通過鼻腔免疫能模擬病毒的自然感染,引起局部黏膜和系統(tǒng)免疫,使機體獲得更顯著的免疫原性和更廣泛的保護性。因此,基于以上現(xiàn)狀,本研究立足于創(chuàng)新型RSV疫苗的制備。本研究分兩個部分:一是通過構(gòu)建重組RSV F蛋白自組裝納米顆粒疫苗,探索RSV F蛋白的抗原形式、免疫應(yīng)答方式及免疫保護效果;二是采用冷適應(yīng)流感病毒反向遺傳學(xué)技術(shù),構(gòu)建嵌合RSV中和抗原表位的重組FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗,探索嵌合RSV中和抗原表位的重組FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗的免疫原性及免疫保護效果。一、重組RSV F納米顆粒疫苗株構(gòu)建及免疫效果研究本研究以RSV關(guān)鍵保護性抗原F蛋白分子為靶標,通過昆蟲表達系統(tǒng)制備由多個F蛋白寡聚體自組裝的納米顆粒,并通過滴鼻免疫BABL/c小鼠,檢驗評價其免疫原性及免疫保護效果,為發(fā)展RSV新型疫苗提供試驗依據(jù)。目的:制備重組RSV F納米顆粒(RSV F NPs)疫苗,并對重組疫苗的免疫原性及免疫保護效果進行鑒定,對納米顆粒型疫苗的實踐性和可行性進行初步探討。方法:應(yīng)用生物信息學(xué)方法將野生型RSV F蛋白氨基酸進行點突變設(shè)計,使F蛋白糖基化修飾,同時對改造后氨基酸序列進行密碼子優(yōu)化。利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建pFastBacⅠ-F質(zhì)粒,通過轉(zhuǎn)座得到重組桿粒Bacmid-F,桿粒轉(zhuǎn)染sf9細胞獲得穩(wěn)定表達的桿狀病毒株。擴大培養(yǎng)后經(jīng)超濾濃縮、親和層析方法純化F蛋白,采用Western blot、電鏡等方法鑒定觀察納米顆粒組裝情況。RSV F納米顆粒疫苗滴鼻免疫BABL/c小鼠,ELISA法檢測小鼠血清中特異性抗體及鼻肺灌洗液中s IgA抗體效價,微量中和檢測針對RSV病毒的中和抗體,ELISPOT法檢測脾淋巴細胞分泌特異性細胞因子水平。RSV A2株攻毒后,通過檢測小鼠體重變化、病毒載量等指標判定重組RSV-F NPs免疫保護效果。結(jié)果:構(gòu)建質(zhì)粒及桿粒位置大小正確,純度適當(dāng)。重組病毒DNA大小正確病毒最佳接種MOI為0.1,獲得重組病毒F-opt毒力為109TCID50/ml。WB鑒定65KD處有特異性條帶,證明重組RSV F蛋白的表達。電鏡觀察納米顆粒結(jié)構(gòu)形態(tài)完整呈 玫瑰花‖狀,證明納米顆粒組裝成功。滴鼻免疫BABL/c小鼠,試驗結(jié)果顯示:二免后10μg NPs低劑量組、30μg NPs高劑量組的特異性IgG、IgG1、IgG2a抗體效價均有明顯升高,30μg NPs高劑量組二次免疫IgG效價達到103.682±0.05,明顯高于10μg NPs低劑量組(P0.001)。IgG1/IgG2a1,表明重組RSV F NPs疫苗株能夠產(chǎn)生偏向Th1型細胞免疫應(yīng)答。與肌肉免疫組比較,滴鼻免疫組小鼠產(chǎn)生s Ig A型特異性抗體,30μg NPs高劑量組鼻灌洗液效價達到101.7±0.03、肺灌洗達到102.3±0.7。體外中和實驗證明RSV F NPs疫苗能夠激發(fā)小鼠產(chǎn)生中和抗體,30μg NPs高劑量組中和抗體效價達到102±0.13。檢測脾細胞分泌的IFN-γ及IL-4細胞因子顯著升高。攻毒后,免疫組的小鼠鼻肺病毒載量降低、小鼠體重?zé)o明顯變化、肺部病理變化不明顯、IL-4細胞因子無明顯升高,初步說明疫苗沒有造成ERD。結(jié)論:成功制備重組RSV-F NPs疫苗。動物試驗證明重組RSV-F NPs疫苗能夠有效刺激小鼠產(chǎn)生有效的黏膜免疫、細胞免疫及體液免疫應(yīng)答,能夠產(chǎn)生中和抗體,證明重組RSV-F NPs疫苗具有良好的免疫原性,攻毒試驗證明重組RSV-F NPs疫苗具有良好的免疫保護效果。二、重組嵌合FLU/RSV/NA-3F疫苗株制備及免疫效果研究本研究利用冷適應(yīng)流感病毒作為嵌合疫苗的載體,制備重組嵌合FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗。通過免疫BABL/c小鼠,對重組嵌合FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗的免疫原性和免疫保護效果進行評價。目的:制備重組嵌合FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗,評價重組嵌合FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗的免疫原性及免疫保護性,為研制安全、有效的重組RSV減毒活疫苗株提供數(shù)據(jù)支持。方法:利用生物信息學(xué)方法,對A/California/07/2009(H1N1)株NA基因進行改造,并將RSV F蛋白的中和表位II重復(fù)三次后通過柔性氨基酸連接,插入NA基因序列中,組成重組NA-3F目的基因。重組質(zhì)粒與A/California/07/2009(H1N1)的HA及A/Ann Arbor/6/60(H2N2)的6質(zhì)粒共組成八質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染MDCK/COS1細胞后得到重組FLU/RSV/NA-3F病毒。經(jīng)雞胚傳代擴增,得到穩(wěn)定傳代的候選疫苗株。通過血凝實驗、TCID50、Western blot、電鏡等方法對重組FLU/RSV/NA-3F疫苗株進行鑒定。純化重組FLU/RSV/NA-3F疫苗株,10~4TCID_(50)、10~6TCID_(50)兩劑量組滴鼻免疫BABL/c小鼠,ELISA法檢測小鼠血清中特異性抗體及鼻肺灌洗液中s IgA抗體效價,HI檢測小鼠血清中針對流感的中和抗體,微量中和檢測針對RSV病毒的中和抗體,ELISPOT法檢測脾淋巴分泌細胞因子水平。RSV A2株攻毒后,通過對小鼠體重變化、肺病毒載量及肺病理切片等指標,評價重組FLU/RSV/NA-3F疫苗株的免疫保護性。被動免疫后,用鼻肺病毒載量及肺病理切片評價疫苗的預(yù)防效果。結(jié)果:構(gòu)建質(zhì)粒位置大小正確,純度適當(dāng),測序完全正確。用于重組八質(zhì)�；蛐蛄姓_,并成功拯救出重組FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗株。Western blot鑒定63KD處有特異性條帶,證明嵌合蛋白的表達。電鏡觀察重組病毒結(jié)構(gòu)完整,形態(tài)符合流感病毒特征。純化病毒后血凝滴度為1:29,毒力為10~8TCID_(50)/ml。體外復(fù)制結(jié)果證明重組FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗株與A/California/07/2009(H1N1)疫苗株具有相似的復(fù)制特性,最適溫度33℃。10~4TCID_(50)、10~6TCID_(50)兩劑量組滴鼻免疫BABL/c小鼠后,10~4TCID_(50)、10~6TCID_(50)兩劑量組均產(chǎn)生針對RSV的IgG、IgG1、IgG2a型特異性抗體的升高,10~6TCID_(50)高劑量二免后IgG效價達到103.372±0.126,高于10~4TCID_(50)低劑量組(P0.001)。IgG1/IgG2a1,表明重組FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗株能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生趨于Th1型細胞免疫應(yīng)答。免疫組小鼠產(chǎn)生明顯的s Ig A型特異性抗體升高,10~6TCID_(50)劑量組鼻灌洗液效價達到102.1±0.5,肺灌洗液效價達到102.9。微量中和實驗表明重組FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗株能夠產(chǎn)生針對RSV的中和抗體,中和效價101.75±0.053;HI實驗表明能夠產(chǎn)生針對流感病毒的中和抗體,效價達到1:640。檢測脾細胞分泌的IFN-γ及IL-4細胞因子顯著升高。攻毒后,兩組小鼠的鼻肺病毒載量均降低,10~6TCID_(50)高劑量組小鼠鼻組織中的病毒載量為101.147±0.02,小鼠肺組織中的病毒載量為102.181±0.02。小鼠體重?zé)o明顯變化、肺部無明顯病理變化,IL-4細胞因子無明顯升高,沒有出現(xiàn)ERD癥狀。被動免疫中,小鼠肺組織研磨液中的病毒載量為103.1±0.015(P0.01)。結(jié)論:成功制備重組嵌合FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗。動物試驗證明重組嵌合FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗能夠有效刺激小鼠機體產(chǎn)生粘膜免疫、細胞免疫及體液免疫應(yīng)答,能夠產(chǎn)生中和抗體,證明重組嵌合FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗具有良好的免疫原性。攻毒試驗證明重組嵌合FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗具有良好的免疫保護效果。被動免疫實驗證明免疫血清在減少RSV肺中的復(fù)制、肺組織病變方面發(fā)揮作用。通過制備RSV F NPs疫苗和重組嵌合FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗,探索RSV疫苗的有效形式,達到高效的免疫原性和免疫保護效果,并力求解決Th1/Th2不平衡等問題,為RSV疫苗候選株提供有力數(shù)據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1524398