本文關(guān)鍵詞： RIP SRSF1蛋白 RNA測(cè)序 性發(fā)育　出處：《東華大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：在哺乳動(dòng)物中,性發(fā)育啟動(dòng)受到下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控,其分泌的各種激素直接或間接調(diào)控著性發(fā)育的啟動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)室利用雜交F2代和同類(lèi)系,進(jìn)行全基因組的STR掃描和ISCSs精細(xì)定位,篩選出miR-505-3P作為可靠的候選基因。利用表達(dá)譜和Targetscan預(yù)測(cè)并驗(yàn)證得到SRSF1是miR-505-3p的靶基因。通過(guò)在過(guò)表達(dá)miR-505-3p的GT1-7中過(guò)表達(dá)SRSF1編碼區(qū),發(fā)現(xiàn)miR-505-3p所抑制的性發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)水平有不同程度的恢復(fù),說(shuō)明SRSF1可以促進(jìn)性發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。而SRSF1是如何通過(guò)下游基因來(lái)影響性發(fā)育亟待研究。本研究首先以Hela細(xì)胞為模型,構(gòu)建甲醛交聯(lián)RNA免疫共沉淀(RNA Immunoprecipitation,RIP)方案。第一步,針對(duì)細(xì)胞固定條件、裂解液強(qiáng)度及超聲條件進(jìn)行摸索,結(jié)果顯示以0.1%甲醛固定細(xì)胞,選擇1%NP-40的低強(qiáng)度裂解液,結(jié)合低超聲條件處理固定細(xì)胞,成功捕獲目的蛋白及其相互作用的RNA。第二步,針對(duì)RIP捕獲的SRSF1蛋白相互作用的RNA樣本,建立RNA富集效率檢測(cè)方案。以釀酒酵母RNA的β-actin作為內(nèi)參,采用qPCR技術(shù)精準(zhǔn)定量檢測(cè)目標(biāo)RNA的富集效率。結(jié)果顯示,0.1%甲醛交聯(lián)RIP技術(shù)特異性捕獲得到SRSF1蛋白-RNA復(fù)合物;qPCR技術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性基因PABP、SRSF1在SRSF1抗體捕獲的產(chǎn)物和IgG抗體的產(chǎn)物中相應(yīng)RNA的濃度差異均在60倍以上。利用上述建立的RIP技術(shù),在GT1-7細(xì)胞中特異性捕獲SRSF1蛋白相互作用的RNA。同時(shí)結(jié)合western blot和考馬斯染色的結(jié)果,確保適當(dāng)?shù)目贵w量高效富集細(xì)胞內(nèi)源性目的RNA,并將捕獲的目的RNA進(jìn)行測(cè)序。之后,首先將測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)用NGStookit軟件進(jìn)行質(zhì)控處理,然后用tophat軟件將過(guò)濾之后的reads比對(duì)到小鼠基因組上,再用cufflink軟件將比對(duì)結(jié)果進(jìn)行拼接及表達(dá)量的計(jì)算。根據(jù)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組表達(dá)量的差異篩選出與SRSF1蛋白相互作用的基因,篩選標(biāo)準(zhǔn)是差異倍數(shù)大于2倍的基因作為候選基因。之后對(duì)篩選出的候選基因進(jìn)行GO注釋和KEGG注釋,獲得候選基因的功能信息,最終找出并驗(yàn)證與性發(fā)育相關(guān)的13個(gè)基因。這些工作為性發(fā)育的分子機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ),從而為性早熟,生殖障礙的預(yù)防、鑒別診斷和治療提供分子靶點(diǎn)和理論依據(jù),同時(shí)對(duì)人類(lèi)正常生殖功能的維持及生殖障礙的預(yù)防將有更全面的了解。
[Abstract]:In mammals, the initiation of sexual development is regulated by the hypothalamus-pituitary-gonadal axis, and the hormones secreted by it directly or indirectly regulate the initiation of sexual development. STR scanning and ISCSs fine mapping of the whole genome were performed to screen miR-505-3P as a reliable candidate gene. Expression profiles and Targetscan were used to predict and verify that SRSF1 was the target gene of miR-505-3p. It was found that the expression level of sex-development-related genes inhibited by miR-505-3p recovered to varying degrees. It is suggested that SRSF1 can promote the expression of genes associated with sexual development. However, it is urgent to study how SRSF1 affects sexual development through downstream genes. The first step of this study was to construct a formaldehyde-crosslinked RNA immunoprecipitation scheme based on Hela cells. The results showed that the fixed cells were fixed with 0.1% formaldehyde, and the cells were treated with NP-40 low intensity lytic solution, combined with low ultrasound condition, according to the condition of cell immobilization, the intensity of lysate and the ultrasonic condition, the results showed that the cells were fixed with 0.1% formaldehyde. The second step of successfully capturing the target protein and its interaction, the RNA sample of SRSF1 protein interaction captured by RIP was used to establish a RNA enrichment efficiency detection scheme. 尾 -actin of Saccharomyces cerevisiae RNA was used as the internal control, and 尾 -actin from Saccharomyces cerevisiae was used as internal control. The enrichment efficiency of target RNA was accurately and quantitatively detected by qPCR technique. The results showed that 0.1% formaldehyde crosslinked RIP technique was specific to capture SRSF1 protein-RNA complex qPCR to detect the captured products of the positive gene PABPP-SRSF1 in SRSF1 antibody and the IgG antibody. The concentration difference of corresponding RNA in the product is more than 60 times. Using the established RIP technology, The specific SRSF1 protein interaction was captured in GT1-7 cells. Combined with the results of western blot and Cormas staining, it was ensured that appropriate antibody levels were highly efficient in enriching cellular endogenous RNAs, and the captured target RNA was sequenced. The original data obtained by sequencing was first processed with NGStookit software for quality control, and then filtered reads was compared to the mouse genome by tophat software. The results were spliced and expressed by cufflink software. According to the difference of expression between experimental group and control group, the genes interacting with SRSF1 protein were screened out. The screening criteria are that the genes whose difference ratio is more than 2 times are used as candidate genes. Then go annotation and KEGG annotation are carried out to obtain the functional information of the candidate genes. Finally, 13 genes related to sexual development were identified and verified. These work laid the foundation for the study of the molecular mechanism of sexual development, thus providing molecular targets and theoretical basis for precocious puberty, prevention of reproductive disorders, differential diagnosis and treatment. At the same time, the maintenance of human normal reproductive function and the prevention of reproductive disorders will have a more comprehensive understanding.
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：1522169