本文關(guān)鍵詞： 芥菜 AGL18 蛋白-蛋白互作 蛋白-DNA互作 轉(zhuǎn)基因　出處：《西南大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：芥菜(Brassica juncea Coss.)是蕓薹屬重要的蔬菜作物,栽培多分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū),抽薹開花將嚴(yán)重影響其產(chǎn)品器官的產(chǎn)量和品質(zhì)。前人在擬南芥中的研究表明:大量開花相關(guān)基因編織成一個(gè)龐大而精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),而MADS-box轉(zhuǎn)錄因子(如AGL18)在其中有著重要作用。然而迄今為止,芥菜中開花抑制因子AGL18與其他開花時(shí)間基因在整個(gè)開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)系尚未見報(bào)道,AGL18調(diào)控芥菜開花時(shí)間的分子機(jī)制也不清楚。為了闡明芥菜AGL18的作用機(jī)制,本研究從芥菜中克隆了AGL18,利用酵母雙雜交技術(shù)和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)研究了AGL18與SOC1、AGL24間的蛋白-蛋白互作;并通過(guò)酵母單雜交技術(shù)和Dual-Glo?雙螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)研究了AGL18與SOC1和AGL24間的蛋白-DNA互作;篩選出了AGL18與SOC1/SOC1和AGL24/AGL24的互作區(qū)域,同時(shí)又進(jìn)一步篩選和驗(yàn)證了蛋白互作的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn);并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化芥菜和煙草,對(duì)基因功能作了初步的驗(yàn)證和分析。為深入研究芥菜AGL18對(duì)開花時(shí)間的影響奠定了基礎(chǔ)。主要試驗(yàn)結(jié)果如下:1.芥菜AGL18基因的克隆與生物信息學(xué)分析試驗(yàn)從苗期和花期芥菜中克隆得到3條AGL18 cDNA序列(花期,AGL18-1;苗期,AGL18-2和AGL18-3),序列分析表明3條序列與十字花科蕪菁和油菜的核苷酸序列同源性最高。芥菜AGL18Δ1-3蛋白屬于MIKCc型蛋白,分別編碼257、257和258個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)量分別為29.01 kD、28.73 kD和29.34 kD,理論等電點(diǎn)為5.65、5.15和5.86,均為不穩(wěn)定親水性蛋白。2.芥菜AGL18s蛋白均與SOC1蛋白沒有相互作用試驗(yàn)分別以pGADT7-AGL18Δ1-3和pGBKT7-AGL18Δ1-3做為誘餌質(zhì)粒進(jìn)行了驗(yàn)證,酵母雙雜交試驗(yàn)表明,芥菜AGL18Δ1-3與SOC1蛋白沒有相互作用。BiFC試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),本氏煙葉片經(jīng)混合菌液侵染后在激光共聚焦顯微鏡下無(wú)熒光產(chǎn)生,進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)論。3.芥菜AGL18-1蛋白與SOC1啟動(dòng)子互作酵母單雜交表明,只有Y1HGold[(pAbAi-SOC1)×(pGADT7-AGL18-1)]能夠在SD/-Leu/AbA100固體培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng),說(shuō)明AGL18Δ1-3蛋白中只有AGL18-1蛋白與SOC1啟動(dòng)子有相互作用。雙螢光素酶活性檢測(cè)表明,試驗(yàn)組螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值顯著高于陰性對(duì)照組的比值,說(shuō)明AGL18-1蛋白與SOC1在植物細(xì)胞內(nèi)可以互作。4.芥菜AGL18-1/SOC1的蛋白-DNA互作區(qū)域?yàn)镸域試驗(yàn)已證實(shí)只有AGL18-1蛋白與SOC1啟動(dòng)子間存在蛋白-DNA互作,為了進(jìn)一步篩選出具體的作用區(qū)域,試驗(yàn)單獨(dú)截取M域和IKC域。酵母單雜交技術(shù)表明,只有M域截短體與SOC1啟動(dòng)子融合后可以在SD/-Leu/AbA100固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出白色菌落,說(shuō)明M域是發(fā)生蛋白-DNA互作的關(guān)鍵部位。5.芥菜AGL18Δ1-3蛋白均與AGL24蛋白互作試驗(yàn)以Y2HGold(pGBKT7-AGL18Δ1-3)為誘餌蛋白,Y187(pGADT7-AGL24)為獵物蛋白,酵母雙雜交試驗(yàn)說(shuō)明AGL18Δ1-3能夠與AGL24結(jié)合,并激活報(bào)告基因ADE2、AUR1-C、HIS3和MEL1。Bi FC試驗(yàn)表明,本氏煙葉片經(jīng)共侵潤(rùn)液侵染后能夠在激光共聚焦顯微鏡下產(chǎn)生熒光,說(shuō)明芥菜AGL18Δ1-3蛋白均與AGL24蛋白互作。6.K域是介導(dǎo)芥菜AGL18s/AGL24蛋白互作的關(guān)鍵區(qū)域?yàn)榱诉M(jìn)一步篩選AGL18s/AGL24互作的具體區(qū)域,試驗(yàn)分別截取了AGL18Δ1-3蛋白的M域、K域、MIK域和KC域截短體。酵母雙雜交技術(shù)表明,除M域外,其它均與AGL24蛋白存在相互作用,說(shuō)明了K域是介導(dǎo)AGL18s/AGL24互作的關(guān)鍵區(qū)域。7.芥菜AGL18-1蛋白與AGL24啟動(dòng)子互作酵母單雜交表明,只有Y1HGold[(pAbAi-AGL24)×(pGADT7-AGL18-1)]能夠在SD/-Leu/AbA100固體培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng),說(shuō)明AGL18Δ1-3蛋白中只有AGL18-1蛋白與AGL24啟動(dòng)子有相互作用。雙螢光素酶活性檢測(cè)表明,試驗(yàn)組螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值顯著高于陰性對(duì)照組的比值,說(shuō)明AGL18-1蛋白與AGL24在植物細(xì)胞內(nèi)可以互作。8.芥菜AGL18-1/AGL24的蛋白-DNA互作區(qū)域是M域和K域試驗(yàn)單獨(dú)截取M域、IKC域,K域、MIK域和MK域來(lái)篩選互作區(qū)域,酵母單雜交技術(shù)結(jié)果表明,所有截短體均與AGL24啟動(dòng)子存在相互作用;說(shuō)明M域和K域是AGL18-1/AGL24互作的關(guān)鍵區(qū)域。9.芥菜AGL18Δ1-3突變體與AGL24作用位點(diǎn)的篩選試驗(yàn)利用ISIS系統(tǒng)在線預(yù)測(cè)了AGL18Δ1-3參與蛋白-蛋白相互作用的氨基酸殘基位點(diǎn),成功構(gòu)建了11個(gè)突變體。酵母雙雜交、BiFC和β-半乳糖苷酶活性分析表明AGL18-2L113F、AGL18-2E116H、AGL18-2L118F、AGL18-2K165T、AGL18-3L114P、AGL18-3E117G、AGL18-3R118G和AGL18-3L119P等8個(gè)突變體與AGL24蛋白仍存在相互作用,但會(huì)不同程度的削弱或增強(qiáng)AGL18-2/AGL24和/或AGL18-3/AGL24的互作強(qiáng)度,說(shuō)明這8個(gè)位點(diǎn)不是AGL18-2和AGL18-3蛋白與AGL24蛋白相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)。突變體AGL18-1L114V和AGL18-1E117V均會(huì)顯著削弱AGL18-1/AGL24的互作強(qiáng)度,但彼此間的相互作用并沒有消失,而AGL18-1K190I突變體與AGL24蛋白沒有相互作用,表明AGL18-1蛋白第190位氨基酸是AGL18-1與AGL24互作的關(guān)鍵位點(diǎn)。10.芥菜AGL18Δ1-3正反義載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化為了進(jìn)一步探究芥菜AGL18Δ1-3基因功能,試驗(yàn)將AGL18Δ1-3全長(zhǎng)序列的正、反向分別插入到植雙元表達(dá)載體pBI121。農(nóng)桿菌介導(dǎo)芥菜pBI35S::sAGL18Δ1-3和pBI35S::aAGL18Δ1-3轉(zhuǎn)化芥菜及煙草。成功獲得100余株轉(zhuǎn)基因煙草材料和30余株轉(zhuǎn)基因芥菜材料,并對(duì)轉(zhuǎn)基因芥菜和煙草的表型作了初步觀察。
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【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S637;Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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3 MA Guanpeng;LIU Zhiyu;YANG Puli;XU Junqiang;SONG Ming;TANG Qinglin;;The K Domain Mediates Homologous and Heterologous Interactions Between FLC and SVP Proteins of Brassica juncea[J];Horticultural Plant Journal;2015年01期

4 謝婷;谷慧英;江為;馬關(guān)鵬;陳嬌;王志敏;宋明;湯青林;;芥菜開花整合子SOC1與AGL24蛋白K結(jié)構(gòu)域的互作位點(diǎn)鑒定[J];園藝學(xué)報(bào);2015年03期

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本文編號(hào)：1488826