發(fā)布時間：2018-02-03 08:45

  本文關鍵詞： MicroRNA 過表達動物模型 慢病毒 性發(fā)育相關基因 靶基因　出處：《東華大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景:Micro RNAs(miRNAs)是一組進化上高度保守的內(nèi)源性非編碼小RNA,長約21~25個核苷酸,能通過靶向結(jié)合并斷裂目的m RNA或抑制m RNA的蛋白質(zhì)翻譯來調(diào)控生物學的進程。據(jù)報道人類所有的背景:Micro RNAs(miRNAs)是一組進化上高度保守的內(nèi)源性非編碼小RNA,長約21~25個核苷酸,能通過靶向結(jié)合并斷裂目的m RNA或抑制m RNA的蛋白質(zhì)翻譯來調(diào)控生物學的進程。據(jù)報道人類所有的miRNA約占基因總數(shù)的3%,可能調(diào)控人體細胞中約30%的蛋白質(zhì)編碼基因。本實驗之前所作的小鼠腦組織中的基因芯片數(shù)據(jù)顯示在小鼠性發(fā)育過程中miR-29b的表達中出現(xiàn)了顯著變化,此外取不同生長周期的小鼠下丘腦的組織進行檢測,發(fā)現(xiàn)miR-29b的表達量也出現(xiàn)明顯差異,表明miR-29b可能在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用從而調(diào)控個體的生長發(fā)育,推斷是一種與性發(fā)育相關的micro RNA。目的:在小鼠下丘腦來源的細胞GT1-7中,構(gòu)建miR-29b穩(wěn)轉(zhuǎn)株,檢測過表達后對靶基因,性發(fā)育相關基因的影響;轉(zhuǎn)染micro RNA-29mimics,探究來自同一家族成員miR-29a和miR-29b之間的協(xié)同調(diào)控作用;利用下丘腦原位注射構(gòu)建miR-29b過表達小鼠模型,通過小鼠的性發(fā)育相關表型觀測,探索miR-29b與性發(fā)育調(diào)控之間的關系。方法:構(gòu)建miR-29a和miR-29b的慢病毒表達載體,包裝成病毒顆粒轉(zhuǎn)染GT1-7細胞中,利用博來霉素篩選14天后,獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)株,通過熒光定量PCR進行miR-29表達量檢測,以確定穩(wěn)轉(zhuǎn)株是否可以作為miR-29過表達細胞模型加以應用;將miR-29a mimic,miR-29b mimic分別轉(zhuǎn)染到GT1-7細胞,通過熒光定量PCR檢測二者之間是否存在相互作用,并通過性發(fā)育相關基因表達量分析,研究miR-29的生物學功能;通過下丘腦定位注射的方式,將miR-29b慢病毒顆粒注射到出生12天的雌性C57/B6小鼠的下丘腦中,觀察和記錄miR-29b下丘腦過表達小鼠的體重增長、陰門開啟時間、合籠到生育時長、子鼠出生數(shù)量、子鼠死亡率等性發(fā)育表型,以確定miR-29是否參與了小鼠性發(fā)育啟動的調(diào)控。結(jié)果:在細胞實驗方面,過表達miR-29b的GT1-7細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株中,miR-29b的表達量上升大約28倍,同時3種靶基因(DCX,Vdac1,Pten)的表達量都出現(xiàn)了不同程度的下降,DCX表達量下降了44%左右,Vdac1表達量下降了16%左右,Pten表達量下降了17%左右,LH-β,kiss-1,Inshulin,IGF-I,GPR54,Gn RH,leptin-R等7個與性發(fā)育相關的基因表達量水平?jīng)]有明顯變化;探究來自同一家族兩種micro RNA之間的相互作用,轉(zhuǎn)染miR-29a mimic后,結(jié)果表明miR-29a的表達量顯著提高,增加了91倍左右,然而miR-29b的表達量沒有顯著的變化,同時檢測與性發(fā)育相關的幾個基因,發(fā)現(xiàn)只有Leptin-R表達水平下降了9.5%,同樣在轉(zhuǎn)染miR-29b mimic后,miR-29b的表達量也顯著上升,提高105倍左右,然而miR-29a也沒有太大變化。檢測與性發(fā)育相關的幾種基因,Leptin-R表達水平下降了10.2%。表明miR-29a,miR-29b雖然來自相同的家族,有著相同的種子序列,但它們之間不會有一種miRNA高表達之后對另一種miRNA產(chǎn)生影響;在動物實驗方面,注射小鼠下丘腦中miR-29b的表達量明顯上升,表明利用該方法成功構(gòu)建miR-29b在下丘腦中過表達的小鼠模型。檢測與性發(fā)育相關基因時,發(fā)現(xiàn)kiss-1,Inshulin,IGF-I,GPR54,Gn RH,LH-β在三組中沒有變化,Leptin-R的表達量在慢病毒組中顯著下降。與對照組相比,miR-29b慢病毒注射小鼠的平均體重輕了2g左右,且體重增長緩慢,陰門開啟時間為35.38±0.9161(天),推遲了2天,與雄鼠合籠后,從合籠到子鼠出生時間平均為25.33±0.8165(天),推遲了2天,出生子鼠的數(shù)量為6.167±0.167(只)較對照組會減少1只,子鼠出生后,慢病毒注射組相比對照組出現(xiàn)了高的死亡比例,慢病毒死亡數(shù)為1.500±0.224(只),每窩子鼠死亡數(shù)量達到1.5只。結(jié)論:在細胞實驗方面,利用慢病毒成功構(gòu)建了過表達miR-29b的GT1-7細胞的穩(wěn)轉(zhuǎn)株,在穩(wěn)轉(zhuǎn)株中檢測到3種靶基因的表達量都出現(xiàn)了不同程度的下降,性發(fā)育相關基因除了Leptin-R以外都沒有明顯變化;轉(zhuǎn)染miR-29 mimic的結(jié)果顯示,過表達一種miR-29家族成員,不會對同一個家族的其他成員的表達量產(chǎn)生影響;在動物實驗方面,利用慢病毒注射未成年小鼠下丘腦腦區(qū)的方法,成功構(gòu)建下丘腦中miR-29b過表達的小鼠模型,miR-29b的表達水平上升4倍左右,在檢測與性發(fā)育相關基因時,結(jié)果顯示kiss-1,Inshulin,IGF-I,GPR54,Gn RH,在生理鹽水,空載體FUGW,慢病毒中沒有變化,Leptin-R的表達量在慢病毒組中有所下降。模型小鼠與對照小鼠相比在體重增長,陰門開啟,合籠時間,子鼠出生數(shù)量,子鼠死亡數(shù)量等一系列的表型中出現(xiàn)差異,表明miR-29b的過表達對小鼠的性發(fā)育產(chǎn)生了影響,為進一步研究小鼠性發(fā)育提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:BACKGROUND : Micro RNAs ( microRNAs ) are a group of highly conserved endogenous non - coding small RNA , which is about 21 ~ 25 nucleotides in length . It can regulate the biological process by targeted binding and cleavage of mRNA or protein translation of m RNA . It is reported that the expression of miR - 29b plays an important role in the development of the mammalian nervous system . It is suggested that miR - 29b can be used as a miR - 29 overexpression cell model . It is suggested that miR - 29b can be used as a miR - 29 overexpression cell model . The expression of miR - 29b was decreased by about 28 - fold , and the expression of miR - 29b was decreased by about 28 - fold , while the expression of miR - 29b was decreased by about 44 % . Compared with the control group , the expression level of miR - 29b was reduced by about 2 g . Compared with the control group , the expression level of miR - 29b was significantly decreased .

【學位授予單位】：東華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

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1 李文文;MicroRNA-29與小鼠性發(fā)育調(diào)控相關的功能研究[D];東華大學;2017年

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本文編號：1486935