本文關鍵詞：苦蕎黃酮合酶FLS2和FLS3的基因克隆及其最適底物分析　出處：《四川農業(yè)大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 苦蕎 黃酮醇合酶 基因克隆 原核表達 動力學參數(shù)

【摘要】：苦蕎(Fagopyrum tatarium)是一種藥食兩用植物,不僅具有豐富的營養(yǎng),而且富含以蘆丁為代表的黃酮醇類化合物。黃酮醇合成是植物苯丙烷代謝途徑的支路之一,在黃酮醇合酶(Flavonols synthetase, FLS)的催化下,二氫槲皮素(Dihyquercetin, DHQ)、二氫山奈酚(Dihykaempferol, DHK)和二氫楊梅素(Dihydromyricetin, DHM)等3種二氫黃酮醇可轉化為槲皮素、山奈酚和楊梅素等3種黃酮醇,其中槲皮素經糖基化后轉變?yōu)樘J丁。已有研究表明,苦蕎FtFLS基因在染色體上存在多拷貝,預示具有不同的FtFLS同源蛋白參與了苦蕎蘆丁的合成。本研究基于苦蕎花期轉錄組數(shù)據(jù),克隆了苦蕎黃酮醇合酶同源蛋白的兩條基因FtFLS2和FtFLS3,并進行生物信息學分析：實現(xiàn)其在大腸桿菌中的表達,比較了FtFLS1、FtFLS2和FtFLS3等3個重組苦蕎黃酮醇合酶對3種底物的動力學參數(shù),分析了它們在苦蕎蘆丁合成中的最適底物。本研究取得了以下主要結果：1.采用同源克隆和RACE技術,獲得2條苦蕎黃酮醇合酶同源基因的ORF序列,命名為FtFLS2和FtFLS3。序列分析表明,FtFLS2的ORF為996 bp,編碼331個氨基酸殘基的蛋白,推導的FtFLS2蛋白相對分子量為37.8 KDa,分子式為C1771H2651N4510502S10,pI為5.52；FtFLS3的ORF為1008 bp,編碼335個氨基酸殘基的蛋白,推導的FtFLS3蛋白相對分子量為38.1 KDa,分子式為C1723H2689N449O509S10,pI為5.74。Blast分析表明,FtFLS2和FtFLS3與已知的FtFLS1(GenBank ID:JX401285.1)的相似性分別為97%和77%。多重序列比對顯示,FtFLS2和FtFLS3含有2-ODD家族蛋白的保守功能區(qū)Conserved domain A、Conserved domain B、Fe2+離子結合位點和2-酮戊二酸結合位點,屬于典型的2-酮戊二酸依賴型的雙加氧酶。同源進化樹分析表明,FtFLS2與葡萄(Vitis vinifera)的VvFLS (GenBank ID:AB213566)聚為簇Ⅲ,FtFLS3與FtFLS 1和甜蕎(Fagopyrum esculentum)FeFLS聚為簇Ⅰ,推測它們可能具有不同的催化特征。2.構建FtFLS2和FtFLS3的原核表達載體pET30-FtFLS2和pET30-FtFLS3,并在大腸桿菌中實現(xiàn)的可溶性表達。SDS-PAGE分析表明,重組FtFLS2和FtFLS3蛋白分子量分別為37.8 KDa和38.1 KDa。pET30-FtFLS2和pET30-FtFLS3,及本課題組已獲得的基因工程菌pET30-FtFLSl,均置于1 mmol/L IPTG,25℃條件下,誘導10 h。菌體經超聲波破碎,鎳親和層析,獲得電泳純FtFLS1、FtFLS2和FtFLS3重組蛋白。薄層層析(TLC)分析表明,3個FtFLS均具有將DHQ轉化為槲皮素的活性。在100μmol/L DHQ的反應液中,12.5μg的三種FtFLS蛋白均在15min內催化生成的槲皮素量與反應時間呈直線相關。采用雙倒數(shù)作圖法,測定3個重組FtFLS對DHQ、 DHK和DHM的酶促反應動力學參數(shù),結果顯示：對3種二氫黃酮醇的米氏常數(shù),FtFLS 1分別為KmDHQ=594.17μmol/L (VmaxDHQ=42.55 μmol/L-min),KmDHK=1257.18 μmol/L (VmaxDHQ= 25.53 μmol/L-min)和=1516.36 μmol/L (VmaxDHM=17.76 μmol/L-min); FtFLS2分別為KmDHQ=8411.27μmol/L (VmaxDHQ= 10.25 μmol/L-min), K= 23646.74 μmol/L (VmaxDHQ-13.59 μmol/L-min)和KmDHM=21583.23μmol/L (VmaxDHM=12.15μmol/L·min);FtFLS3分別為KmDHQ=6478.21μmol/L(VmaxDHQ=13.97 μmol/L-min), KmDHK=717.93 μmol/L (VmaxDHQ=24.04 μmol/L-min)和KmDHM=1609.36 μol/L (VmaxDHM=17.83 μmol/L-min)。分析表明,FtFLS 1和FtFLS2的最適底物均為DHQ, FtFLS3的最適底物為DHK。以上研究結果,加深了對苦蕎黃酮醇合成支路代謝流向和流量的認識。
[Abstract]:Three kinds of flavonol glycosides ( FtFLS2 and FtFLS3 ) , such as quercitrin ( DHQ ) , dihydroquercetin ( DHK ) , dihydroquercetin ( DHK ) and dihydroquercetin ( FtFLS2 ) , were synthesized from three kinds of flavonol glycosides ( FtFLS2 and FtFLS3 ) . The results showed that the recombinant FtFLS2 and FtFLS3 protein had different catalytic characteristics . The results showed that the recombinant FtFLS2 and FtFLS3 protein had different catalytic characteristics . FtFLS2 was KmDHQ = 8411 . 27渭mol / L ( VmaxDHQ = 10.25 渭mol / L - min ) , K = 23646.74 渭mol / L ( VmaxDHQ - 13.59 渭mol / L - min ) and KmDHM = 21583.23 渭mol / L ( VmaxDHM = 12.15 渭mol / L 路 min ) ; FtFLS3 was KmDHQ = 6478.21 渭mol / L ( VmaxDHQ = 13.97 渭mol / L - min ) , KmDHK = 717.93 渭mol / L ( VmaxDHQ = 24.04 渭mol / L - min ) and KmDHM = 1609.36 渭mol / L ( VmaxDHM = 17.83 渭mol / L - min ) . The results showed that the optimal substrates for FtFLS 1 and FtFLS2 were DHQ and DHK . The results showed that the optimal substrates for FtFLS 1 and FtFLS2 were DHK and DHK .

【學位授予單位】：四川農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 胡耀輝;王冠;劉凱;于寒松;;苦蕎中查爾酮合成酶全長基因的克隆及其序列分析[J];生物技術通報;2011年07期

2 李學俊;郭彥飛;閆倩;陳鵬;;苦蕎類過敏原的原核表達及多克隆抗體制備[J];西北植物學報;2011年08期

3 時政;黃凱豐;陳慶富;;貴州不同生態(tài)區(qū)苦蕎產量性狀形成的初步分析[J];四川大學學報(自然科學版);2011年05期

4 史興海;李秀蓮;高偉;林如法;崔林;;山西省苦蕎種質資源營養(yǎng)特性研究[J];中國科技信息;2012年09期

5 程樹萍;;苦蕎引種試驗報告[J];中國科技信息;2012年21期

6 石艷華;張永清;羅海婧;;化學調節(jié)物質浸種對不同水分條件下苦蕎生長及其生理特性的影響[J];西北植物學報;2013年01期

7 王轉花，張政，，林汝法，周明德;苦蕎葉片超氧化物歧化酶的純化及性質研究[J];生物化學雜志;1994年05期

8 嚴偉，張本能;苦蕎部分營養(yǎng)成分分析及評價[J];四川師范大學學報(自然科學版);1995年06期

9 吳云江,陳慶富;二倍體和四倍體栽培苦蕎的細胞學比較研究[J];廣西植物;2001年04期

10 莫日更朝格圖;王鵬科;高金鋒;高小麗;柴巖;;苦蕎地方種質資源的遺傳多樣性分析[J];西北植物學報;2010年02期

相關會議論文 前9條

1 許明;韓亮;李艷琴;;苦蕎黃酮類化合物的穩(wěn)定性研究[A];第三屆泛環(huán)渤海（七省二市）生物化學與分子生物學會——2012年學術交流會論文集[C];2012年

2 李國柱;申慧芳;;輻射誘變選育苦蕎高黃酮突變體的研究[A];第六屆核農學青年科技工作者學術交流會暨中國核學會2011年學術年會核農學分會論文集[C];2011年

3 陳尚敇;王宗德;陳宏偉;邱業(yè)先;;添加鋅素營養(yǎng)液對培養(yǎng)苦蕎芽菜品質的影響[A];中國食品科學技術學會第五屆年會暨第四屆東西方食品業(yè)高層論壇論文摘要集[C];2007年

4 楊春;陜方;薛春生;段亞利;丁衛(wèi)英;;黑苦蕎醋軟膠囊的生產工藝及穩(wěn)定性研究[A];中國食品科學技術學會第五屆年會暨第四屆東西方食品業(yè)高層論壇論文摘要集[C];2007年

5 楊振煌;王轉花;;美拉德反應對苦蕎過敏原Fag t3免疫活性的影響[A];泛環(huán)渤海地區(qū)九省市生物化學與分子生物學會——2011年學術交流會論文集[C];2011年

6 王耀文;夏楠;杜曉磊;徐明;李艷琴;;苦蕎SRAP和SSR分子標記遺傳連鎖圖譜的構建[A];泛環(huán)渤海地區(qū)九省市生物化學與分子生物學會——2011年學術交流會論文集[C];2011年

7 李海平;李靈芝;黃中奎;邢國明;;錳、鋅對苦蕎芽菜生長和品質的影響[A];中國園藝學會第七屆青年學術討論會論文集[C];2006年

8 李海平;李靈芝;鄭少文;邢國明;;硼、鋅對苦蕎芽菜生長和品質的影響[A];中國園藝學會第十屆會員代表大會暨學術討論會論文集[C];2005年

9 劉新宇;楊足君;馮娟;鄧波;龐小峰;任正隆;;蕎麥屬植物分類的FTIR光譜研究[A];中國細胞生物學學會2005年學術大會、青年學術研討會論文摘要集[C];2005年

相關重要報紙文章 前10條

1 王鵬　劉潤合;靈丘兩企業(yè)聯(lián)手做強苦蕎業(yè)[N];大同日報;2007年

2 本報記者 蔣映春;愿涼山苦蕎茶：一路走好[N];涼山日報(漢);2006年

3 林東升;甘洛建成萬畝黑苦蕎示范基地[N];農民日報;2007年

4 記者 翟培天;涼山成為我國最大的苦蕎生產基地[N];四川科技報;2006年

5 梁新民 王虎成;三晉苦蕎研究開發(fā)達國際先進水平[N];太原日報;2006年

6 楊美;甘洛黑苦蕎一枝獨秀[N];涼山日報(漢);2007年

7 本報通訊員;環(huán)太苦蕎 “藥食同補”[N];涼山日報(漢);2008年

8 本報記者 楊揚;我州苦蕎產業(yè)又有新發(fā)展[N];涼山日報(漢);2008年

9 本報記者 王小梅;博士與苦蕎[N];貴州日報;2009年

10 本報記者 田雁 通訊員 劉潤合 王鵬 劉富強;苦蕎“種出”甜蜜生活[N];大同日報;2009年

相關博士學位論文 前4條

1 國旭丹;苦蕎多酚及其改善內皮胰島素抵抗的研究[D];西北農林科技大學;2013年

2 董新純;UV脅迫下苦蕎類黃酮代謝及其防御機制研究[D];山東農業(yè)大學;2006年

3 智秀娟;苦蕎功能成分的研究及NIR技術在蕎麥制品防偽中的應用[D];中國農業(yè)大學;2015年

4 李成磊;苦蕎黃酮合成相關酶基因的克隆、芽期逆境脅迫中的應答及重組FtPAL和FtFLS的酶學活性研究[D];四川農業(yè)大學;2012年

相關碩士學位論文 前10條

1 楊延利;萌發(fā)對苦蕎黃酮合成的影響及萌發(fā)物抑菌、抗腫瘤活性的研究[D];上海師范大學;2011年

2 劉艷輝;苦蕎麥脫殼工藝及主要參數(shù)的優(yōu)化[D];內蒙古農業(yè)大學;2008年

3 李俊芳;苦蕎在彝族習俗中的社會功能分析[D];云南大學;2012年

4 阮池銀;云南小涼山彝族苦蕎文化的環(huán)境人類學研究[D];云南大學;2012年

5 趙琳;苦蕎萌發(fā)期生理活性及其蛋白抗菌性的研究[D];上海師范大學;2012年

6 李曉丹;苦蕎脅迫萌發(fā)及功能性成分的研究[D];江南大學;2013年

7 陳英嬌;苦蕎蛋白酶解物的制備及抗菌活性的研究[D];上海師范大學;2015年

8 丁俐;苦蕎葉茶加工過程中關鍵工藝參數(shù)及其香氣成分的研究[D];山西農業(yè)大學;2015年

9 朱智慧;施硒對苦蕎抗衰老生理和硒含量的影響[D];山西農業(yè)大學;2015年

10 燕雪芬;苦蕎苯丙氨酸解氨酶（FtPAL）和花青素還原酶（FtANR）的重組表達以及多克隆抗體制備[D];西北農林科技大學;2015年

本文編號：1421810