本文關(guān)鍵詞：家蠶肉堿棕櫚�；D(zhuǎn)移酶BmCPT1基因的鑒定及功能研究　出處：《西南大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：肉堿�；D(zhuǎn)移酶家族(carnitine acyltransferase family)是指生物體內(nèi)存在的能和肉堿結(jié)合的一類酶的總稱,這個家族基因的蛋白質(zhì)序列上有一個相似的酶活催化結(jié)構(gòu)域,因此將他們歸為一個家族。此家族包括乙酰基轉(zhuǎn)移酶(carnitine acetyltransferase,CAT)、肉堿辛�；D(zhuǎn)移酶(carnitine oetanoyltransferse,COT)和肉堿棕櫚�；D(zhuǎn)移酶(carnitine palmitoyltransferse,CPT),其中CPT又分為肉堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoyltransferse 1,CPT1)和肉堿棕櫚�；D(zhuǎn)移酶2(carnitine palmitoyltransferse 2,CPT2),各主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體和線粒體內(nèi),不同的酶選擇性的催化不同碳鏈長度的底物。本文基于已測序的家蠶基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫,以家蠶肉堿�；D(zhuǎn)移酶家族中長鏈脂肪酸分解關(guān)鍵酶BmCPT1基因作為研究對象,對BmCPT1基因進行鑒定、克隆、時空表達分析和功能的研究,探索其在家蠶體內(nèi)脂肪酸代謝過程中的特點。主要研究結(jié)果如下:1、BmCPT1基因的鑒定及序列特征基于家蠶基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫,以已報道的黑腹果蠅CPT1基因的氨基酸序列為問詢序列,進行PSI-BLAST(E0.01)同源性檢索得到家蠶BmCPT1基因。獲得1個BmCPT1基因,此基因定位于家蠶CHr.1號性染色體的nscaf 3068上,含有肉堿棕櫚�；D(zhuǎn)移酶特征的兩段跨膜區(qū)域和位于C端的活性催化結(jié)構(gòu)域。ORF框長2337bp,編碼778個氨基酸,具有信號肽序列,沒有發(fā)現(xiàn)可變剪接體。構(gòu)建不同昆蟲物種內(nèi)同源CPT1基因的序列對比和系統(tǒng)發(fā)生進化樹,發(fā)現(xiàn)昆蟲CPT1基因高度保守。2、BmCPT1基因的表達特征利用逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction,RT-qPCR)技術(shù),分析BmCPT1基因表達模式。BmCPT1基因在大造幼蟲期及五齡三天不同組織的表達結(jié)果表明,Bm CPT1基因在幼蟲期三齡起、四齡起,五齡均表達較高。在大造五齡三天各組織的表達譜中,BmCPT1基因在血液中表達較高,且在不同品種011c、012c、菁松、871和871c間表達譜相似。推斷家幼蟲在發(fā)育變態(tài)時和5齡大蠶時期通過脂肪酸分解代謝功能需求較高。3、不同組織的BmCPT1酶活及基因的亞細胞定位取大造五齡三天不同組織,測定Bm CPT1酶活,發(fā)現(xiàn)酶活性在頭部最高,絲腺組織最低。酶活性由大到小分別是:頭表皮氣管肌肉卵巢馬氏管精巢中腸脂肪體血液絲腺。這一結(jié)果與5齡3天不同組織的能量需求是符合的。亞克隆并表達BmCPT1基因,超純重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞,細胞核染料DAPI和線粒體染料Mitotracker染色后,共聚焦顯微鏡觀察,結(jié)果將BmCPT1基因定位在線粒體。4、BmCPT1基因在不同生長發(fā)育時期及感染細菌后的表達胚胎時期BmCPT1基因在卵的胚胎發(fā)育中表達量不高,但蟻蠶孵化時表達最高;上簇期間至化蛹3天BmCPT1基因表達呈現(xiàn)較低的水平,且雄性比雌性蠶內(nèi)的BmCPT1基因表達量略高;而化蛹4天后BmCPT1基因表達突然升高,且雌蛹比雄蛹內(nèi)的BmCPT1基因表達量顯著高;雌蛾在羽化后前三天BmCPT1基因表達量比雄性顯著高,羽化三天后開始降低但雌蛾仍高于雄蛾,而雄蛾在羽化后五天之內(nèi)表達量無顯著變化;未交配雄和雌蛾BmCPT1基因表達沒有顯著變化,但雄蛾BmCPT1基因表達顯著低于雌蛾;雌、雄蛾交配后雌蛾的BmCPT1基因表達下降極顯著,甚至低于雄蛾。綜上所述,BmCPT1基因功能在蛹期雌造卵和成蟲產(chǎn)卵過程中均具有重要作用。對大造、871不同家蠶5齡幼蟲起蠶注射不同病源物大腸桿菌E.coli和黑胸敗血芽胞桿菌Bb,感病狀況下檢測BmCPT1基因的表達。均發(fā)現(xiàn)注射組3h時,雌、雄性蠶BmCPT1基因表達比對照顯著降低,6h時,在大造和871內(nèi)注射E.coli雄雄蠶和注射Bb雌蠶變化趨勢一致。綜上所述,病菌感染可能引起對脂肪酸氧化供能的利用改變。5、幼蟲和蛹期干涉BmCPT1基因體外注射dsRNA,分子水平檢測均發(fā)現(xiàn)基因表達顯著降低。但注射4齡起蠶時處理組比對照延遲進入眠期4-8小時,注射蛹期沒發(fā)現(xiàn)生物學(xué)意義上的顯著變化,僅僅有分子生物學(xué)的表達變化。綜上所述,家蠶BmCPT1基因的表達受發(fā)育時期,感染細菌狀態(tài),雌雄性別的影響而呈現(xiàn)差異,一定意義上反應(yīng)了不同階段、不同性別在利用脂肪酸能量上的不同,簡言之,幼蟲4齡眠起、五齡眠起、蛹期、蛾期BmCPT1基因表達變化差異明顯,幼蟲期雄高于雌,而蛹期、蛾期雌高于雄,可能體現(xiàn)了這些時期雌雄性別對脂肪酸能量利用上的不同。這些結(jié)果為進一步研究BmCPT1基因的功能奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:In this paper , we studied the characteristics of the gene of Bombyx mori ' s silkworm genome and proteome . The results are as follows : 1 . Identification and sequence characteristics of the gene of Bombyx mori . The main results are as follows : 1 . The gene of Bombyx mori ' s genome and proteome is used as the research object . The results showed that the expression of Bm CPT1 gene was higher than that of male moths . In conclusion , the expression of the gene is different in the stage of development , the status of infected bacteria and the sex of female and male . In conclusion , the difference of the expression of the male and female sex in the larval stage is obviously higher than that of the female , and the pupal stage and the moth stage are higher than that of the male , which may reflect the difference of the sex of the female and the male in the stage of the larva stage . These results provide the foundation for further research on the function of the gene .

【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q55;Q78

【參考文獻】

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本文編號：1382973