本文關(guān)鍵詞：禽波氏桿菌ompA-IgY Fc融合蛋白表達(dá)及松花粉多糖對雞體免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目前對于一些傳染性疾病,滅活苗和活苗已被廣泛應(yīng)用,然而由于疫苗的滅活制備過程,使其抗原的物理及化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而影響了疫苗對機體的免疫保護(hù)能力。隨后,人們生產(chǎn)出的具有天然結(jié)構(gòu)和統(tǒng)一快速生產(chǎn)特性的重組亞單位疫苗也被廣泛用于預(yù)防各種傳染性疾病,然而,由于重組亞單位疫苗在機體的快速清除等影響,使得蛋白質(zhì)或多肽通常具有較短的血清半衰期及有限的抗原刺激。因此為了更有效的控制禽類傳染病,亟需開辟新的途徑,研發(fā)新型疫苗。近年來,將哺乳動物免疫球蛋白Fc與外源蛋白連接的融合技術(shù)已經(jīng)被開發(fā)出來,這種技術(shù)中IgG Fc片段的連接賦予了融合的外源蛋白質(zhì)或多肽類似抗體的特性,不僅增強了對抗原捕獲的速度和效率,同時還增強了融合蛋白的血清半衰期。然而對于融合表達(dá)的IgY Fc是否與融合表達(dá)的IgG Fc一樣,可以有效促進(jìn)動物機體的非特異性免疫應(yīng)答和特異性免疫應(yīng)答,目前還沒有被研究。因次,在本項研究中,實驗室以一種常見的可導(dǎo)致禽類呼吸道疾病的禽波氏桿菌(Borderella avium)中具有免疫原性的外膜蛋白A(ompA)為模型,使用巴斯德畢赤酵母GS115真核表達(dá)系統(tǒng),表達(dá)連接有雞IgY Fc和禽波氏桿菌ompA的融合蛋白;首先檢測ompA-Fc融合蛋白對雞腹腔巨噬細(xì)胞活性的影響,以評價連接的Fc對雞體非特異性免疫應(yīng)答的影響;再將融合蛋白免疫雛雞,以評價連接的Fc對特異性免疫應(yīng)答的影響;此外,本實驗室經(jīng)多年研究發(fā)現(xiàn),泰山松花粉多糖(Taishan pinus massoniana pollen polysaccharide,TPPPS)作為一些滅活疫苗及亞單位疫苗的佐劑時表現(xiàn)出良好的免疫增強效果,因此,TPPPS作為一種免疫調(diào)節(jié)劑對巨噬細(xì)胞的活化,以及用作佐劑對融合蛋白的免疫增強效果也被探究。本研究分以下三部分內(nèi)容:1.ompA-Fc融合蛋白畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的構(gòu)建,表達(dá)及產(chǎn)物分析對Gen Bank中公布的禽波氏桿菌ompA及雞IgY Fc基因序列分別設(shè)計特異性引物,以本實驗室先前分離得到的禽波氏桿菌DNA及本試驗提取的雞脾臟RNA為模板,采用SOE-PCR的方法進(jìn)行重組基因的擴增。隨后對擴增后的重組基因連接轉(zhuǎn)化至pMD18-T克隆載體,同時基因測序鑒定重組克隆載體中重組基因序列,隨后利用限制性內(nèi)切酶Xho I和Not I對測序成功的重組克隆載體進(jìn)行雙酶切及產(chǎn)物膠回收,隨后將回收產(chǎn)物與經(jīng)相同酶酶切后的表達(dá)載體pPIC9再次進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化。之后,將基因測序驗證正確的重組表達(dá)質(zhì)粒線性化,并轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中,對經(jīng)RDB板篩選的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定及基因測序。與此同時,以轉(zhuǎn)化的空質(zhì)粒pPIC9載體做為陰性對照。對經(jīng)PCR檢測正確的畢赤酵母陽性轉(zhuǎn)化子及空質(zhì)粒對照分別進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)后的產(chǎn)物通過SDS-PAGE檢測分析,與蛋白凝膠層中陰性對照孔相比,在陽性孔中顯示有一條與目的蛋白分子量大小一致的約為47.4 kDa的條帶。畢赤酵母表達(dá)的融合蛋白在72 h獲得最大蛋白質(zhì)產(chǎn)量(18 mg/L)。隨后對表達(dá)的蛋白經(jīng)鎳柱進(jìn)行純化,并且SDS-PAGE檢測分析中同樣檢測到一條大小約為47.4 kDa蛋白條帶。分別用抗His標(biāo)簽抗體,大鼠抗omp多克隆抗體和兔抗雞IgG(HRP)進(jìn)行Western blot分析以確定表達(dá)后融合蛋白的免疫原性。在這三次獨立DAB顯色測定后,均觀察到一條大小約47.4 kDa的目的條帶;經(jīng)對照確定該條帶與之前在SDS-PAGE檢測的條帶分子量大小一致。結(jié)果表明,表達(dá)的融合蛋白中IgY Fc和ompA保持其各自獨立的免疫原性。此外,本試驗通過SWISS-MODEL軟件利用同源建模方法預(yù)測融合后ompA-Fc蛋白的三維空間結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)融合蛋白中兩個蛋白在柔性肽的連接下分別進(jìn)行各自空間結(jié)構(gòu)的折疊相互不影響。此外,本實驗室先前構(gòu)建的pPIC9-ompA表達(dá)質(zhì)粒用作本研究中的陰性對照,此表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)的ompA蛋白的免疫原性也進(jìn)行了驗證。2.ompA-Fc融合蛋白與TPPPS對巨噬細(xì)胞活力影響試驗體外培養(yǎng)雞腹腔巨噬細(xì)胞,MTT法測定不同濃度的融合蛋白o(hù)mpA-Fc、ompA及TPPPS對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性,以確定后續(xù)試驗最佳使用劑量。之后分別將特定濃度的ompA-Fc-TPPPS、ompA-Fc、ompA和PBS與腹腔巨噬細(xì)胞共培養(yǎng),中性紅試驗檢測腹腔巨噬細(xì)胞胞飲活性,Griess法、ELISA試劑盒分別檢測腹腔巨噬細(xì)胞NO及TNF-α分泌能力,間接免疫熒光法檢測腹腔巨噬細(xì)胞對ompA吞噬能力,流式細(xì)胞儀檢測腹腔巨噬細(xì)胞分泌MHC-II分子的能力。結(jié)果表明,ompA-Fc、ompA蛋白及TPPPS對腹腔巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒性不明顯,并且TPPPS可劑量依賴性的增加細(xì)胞數(shù)量。同時,TPPPS也劑量依賴性的提高腹腔巨噬細(xì)胞胞飲、NO、TNF-α分泌能力。此外,連接的Fc及TPPPS佐劑也顯著提高了腹腔巨噬細(xì)胞對ompA吞噬活性及MHC-II分子的表達(dá)。以上研究表明,連接IgY Fc的融合蛋白可有效提高腹腔巨噬細(xì)胞的活性,而TPPPS為一種有效巨噬細(xì)胞激活劑。3.TPPPS對融合蛋白的免疫增強效果的研究將本實驗室經(jīng)水提醇沉法提取的泰山松花粉多糖與經(jīng)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)提取的融合蛋白o(hù)mpA-Fc、ompA等體積混合配比制備相應(yīng)疫苗,-80°C備用。隨后對120只SPF雛雞隨機分成4組,之后分別在3、7、14 d后,對各組雛雞進(jìn)行頸部皮下接種0.2 m L ompA-Fc-TPPPS、ompA-Fc、ompA亞單位疫苗和PBS。隨后在首免后的第7、14、21、28、35、42、49 d,對各實驗組隨機抽取3只雞進(jìn)行心臟采血收集樣品,以檢測其血清抗體效價,白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-4(IL-2、IL-4),外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞含量及T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。同時在三免后的1周后,對各組隨機抽取的20只雞攻毒,進(jìn)行動物保護(hù)試驗測定(除對照組),期間連續(xù)7 d對各組雞群臨床癥狀及保護(hù)率進(jìn)行觀察并記錄。試驗結(jié)果表明,單純的ompA-Fc亞單位疫苗可有效誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗ompA特異性抗體,分泌IL-2、IL-4,提高CD4+T、CD8+淋巴細(xì)胞百分含量和T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率,同時提供了近80%的動物保護(hù)率。值得注意的是,TPPPS作為佐劑,能顯著提高機體細(xì)胞及體液免疫反應(yīng)。研究表明,連接的Fc與TPPPS組合協(xié)同促進(jìn)由抗原誘導(dǎo)的全身性免疫應(yīng)答�？傮w而言,本試驗的研究結(jié)果對預(yù)防家禽疾病的亞單位疫苗的研制提供了一個新的思路和方法。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.61;S852.4

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