本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的茂源鏈霉菌高產(chǎn)菌株高產(chǎn)機(jī)制的研究　出處：《華東師范大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.3.2.13,Transglutaminase),是一類催化蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)發(fā)生�；D(zhuǎn)移的一類轉(zhuǎn)移酶,來(lái)源廣泛,存在于動(dòng)物、植物以及微生物中,其中微生物來(lái)源的酶,即微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(microbial transglutaminase,MTG)具有分子量小、鈣不依賴、底物特異性及生產(chǎn)周期短等優(yōu)勢(shì),被廣泛用于食品、醫(yī)藥、紡織業(yè)等工業(yè)化生產(chǎn)當(dāng)中。目前,工業(yè)化生產(chǎn)中,茂源鏈霉菌(Streptomycesmobaraensis)被作為主要的發(fā)酵產(chǎn)酶菌種。野生的茂源鏈霉菌在生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)MTG量較低、生產(chǎn)成本較高等問(wèn)題,從而無(wú)法應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。為解決這一問(wèn)題,實(shí)驗(yàn)人員對(duì)野生菌株進(jìn)行傳統(tǒng)誘變育種及基因工程等手段,以期獲得了高產(chǎn)的菌株,大幅度提高了 MTG的產(chǎn)量,然而傳統(tǒng)的誘變工作量大,負(fù)突變較多,使得篩選工作繁重且效率低。此外,在外源宿主中,MTG產(chǎn)量的相較于原始茂源鏈霉菌而言,提高了很少,且由基因工程改造得到的酶,不能用于食品等領(lǐng)域,加之基因工程手段復(fù)雜精細(xì),因此,無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。綜上所述,對(duì)傳統(tǒng)誘變得到的高產(chǎn)菌株產(chǎn)MTG的高產(chǎn)機(jī)制的研究十分重要。本文從蛋白水平、基因組水平以及轉(zhuǎn)錄水平,分別對(duì)出發(fā)菌株TX1和高產(chǎn)菌株sm2-1進(jìn)行對(duì)比研究,比較兩株菌產(chǎn)MTG在胞內(nèi)胞外蛋白分泌量、基因序列以及轉(zhuǎn)錄水平的差異,探究這些差異對(duì)菌株代謝通路的影響,從而分析出可能的高產(chǎn)機(jī)制。結(jié)果如下:(1)高產(chǎn)菌株和出發(fā)菌株基因組水平的差異。首先對(duì)高產(chǎn)菌株和出發(fā)菌株進(jìn)行基因組重測(cè)序,使用生物信息學(xué)方法對(duì)基因組進(jìn)行分析、預(yù)測(cè)及注釋等。可知,在高產(chǎn)菌株和出發(fā)菌株中pre-pro-MTG基因序列一致,編碼與酶成熟有關(guān)的蛋白等調(diào)控因子如TAMEP、SM-TAP等的基因序列也完全一致。因此,酶產(chǎn)量的提高與酶本身的基因序列及酶成熟過(guò)程無(wú)關(guān)。然而,對(duì)兩株菌進(jìn)行SNV(single nucleotide variant)的分析可知,在編碼區(qū)和非編碼區(qū)分別有數(shù)十個(gè)點(diǎn)突變發(fā)生,其中在MTG的非編碼區(qū)有一個(gè)點(diǎn)突變,且對(duì)該非編碼區(qū)進(jìn)行啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)可知,此突變位點(diǎn)位于啟動(dòng)子區(qū)域。其他點(diǎn)突變分別位于與C代謝、氨基酸合成與代謝、細(xì)胞壁形成以及蛋白跨膜運(yùn)輸?shù)却x通路有關(guān)的酶、蛋白的基因序列或非編碼區(qū)中,可能間接影響MTG的合成和分泌。(2)高產(chǎn)菌株和出發(fā)菌株中谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在胞內(nèi)產(chǎn)量的比較。郭瑋婷等研究者已證明,該酶分泌到胞外時(shí),高產(chǎn)菌株產(chǎn)酶量(pro-MTG)已顯著高于出發(fā)菌株。而谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在胞內(nèi)以pre-pro-MTG形式存在,分別同時(shí)選取兩株菌24h、44h以及50h的發(fā)酵液,提取各菌體裂解的胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行Western Blot。結(jié)果表明,高產(chǎn)菌株pre-pro-MTG轉(zhuǎn)運(yùn)速率較快,前體酶一經(jīng)產(chǎn)生就轉(zhuǎn)出胞外;出發(fā)菌株轉(zhuǎn)運(yùn)速率較慢,一部分前體酶在胞內(nèi)切割成成熟的MTG。(3)對(duì)兩株菌MTG轉(zhuǎn)錄水平的分析可知,以16sRNA為參照,高產(chǎn)菌株MTG的相對(duì)表達(dá)量約為6.9左右,而出發(fā)菌株的相對(duì)表達(dá)量約為0.1左右,高產(chǎn)菌株相較于出發(fā)菌株相對(duì)表達(dá)量提高約60至70倍,p-value值0.0001,即相對(duì)表達(dá)量有顯著差異,證明兩株菌中MTG在RNA水平上有顯著差異,高產(chǎn)菌株顯著高于出發(fā)菌株。(4)結(jié)合基因組水平和轉(zhuǎn)錄水平的差異,使用大腸桿菌質(zhì)粒pSET152作為載體、綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因,對(duì)MTG非編碼區(qū)的點(diǎn)突變與MTG轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量改變的關(guān)系進(jìn)行分析研究,驗(yàn)證了以16sRNA為內(nèi)參基因時(shí),該高產(chǎn)菌株接合子綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)表達(dá)量約138,,出發(fā)菌株接合子綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)表達(dá)量約51,高產(chǎn)菌株接合子較出發(fā)菌株接合子提高約一倍多,p-value值為0.0021,差異顯著,說(shuō)明該點(diǎn)突變對(duì)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)表達(dá)量產(chǎn)生了顯著影響。因此,高產(chǎn)菌株非編碼區(qū)相較于出發(fā)菌株發(fā)生的點(diǎn)突變,是導(dǎo)致pre-pro-MTG轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)表達(dá)量提高的原因。本實(shí)驗(yàn)室保存的茂源鏈霉菌產(chǎn)MTG的產(chǎn)量提高由于MTG上游非編碼區(qū)突變使得MTG在轉(zhuǎn)錄水平上相對(duì)表達(dá)量顯著提高,從而使得MTG蛋白表達(dá)量增加,產(chǎn)酶增加。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q936

【參考文獻(xiàn)】

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