本文關(guān)鍵詞：FOXQ1過表達(dá)對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的抗衰老作用及其機制探究　出處：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：干細(xì)胞是一類具有自我更新能力與多向分化潛能的重要細(xì)胞群體。并且,在阿爾茨海默癥、帕金森癥等研究領(lǐng)域干細(xì)胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的研究已經(jīng)取得了豐碩的成果。其中,臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)具有取材方便,低免疫原性,分化能力強等等優(yōu)勢,成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的重要實驗對象。但是,hUC-MSCs在體外培養(yǎng)條件下,隨著操作中不可避免的機械損傷、化學(xué)處理,使得細(xì)胞增殖分化能力也隨之減弱,最為重要的是干細(xì)胞的干性也隨之降低,這成為嚴(yán)重限制hUC-MSCs臨床實驗應(yīng)用的關(guān)鍵點。FOXQ1是叉頭框蛋白家族(Forkhead box Family,FOX)中一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。近年的腫瘤學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織中,FOXQ1均呈高表達(dá),且其表達(dá)量與病患的腫瘤惡性程度呈現(xiàn)正相關(guān)。同時,在眾多腫瘤細(xì)胞系中,FOXQ1可以調(diào)控癌細(xì)胞增殖、周期、遷移等過程,進(jìn)而調(diào)控腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移。體外實驗證明,通過過表達(dá)或敲除FOXQ1,腫瘤細(xì)胞的增殖能力也隨之增強或減弱。以上結(jié)果提示,FOXQ1在腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移中的具有重要意義,可能成為未來腫瘤學(xué)研究中的基因靶點。鑒于FOXQ1的生物學(xué)功能,研究其能否延緩hUC-MSCs的衰老,促進(jìn)增殖,能否引起細(xì)胞癌變成為實驗研究的重點,同時,相對眾多腫瘤學(xué)研究,此項研究亦是FOXQ1首次在正常體細(xì)胞中研究,而且,hUC-MSCs中FOXQ1的作用機制尚不明確,需要深入的實驗探究。目的通過慢病毒介導(dǎo),過表達(dá)FOXQ1基因后,在衰老的hUC-MSCs中,探究體外體內(nèi)條件下,過表達(dá)FOXQ1是否會對hUC-MSCs產(chǎn)生促進(jìn)增殖、延緩衰老的作用,以及研究FOXQ1在hUC-MSCs中的內(nèi)在調(diào)控機制。方法1、構(gòu)建FOXQ1過表達(dá)的慢病毒載體并在hUC-MSCs中驗證過表達(dá)效果首先,分離臍帶細(xì)胞并進(jìn)行表面抗原鑒定。之后,通過PCR擴增FOXQ1的CDS序列,將其插入慢病毒載體EcoR I與Xba I酶切位點之間,包裝提取純化病毒液。感染hUC-MSCs并通過藥篩建立穩(wěn)定細(xì)胞系。通過western blot與qPCR檢測過表達(dá)組與空載對照組的FOXQ1表達(dá)量差異。2、體外實驗研究FOXQ1過表達(dá)對hUC-MSCs增殖、衰老等相關(guān)指標(biāo)的影響及其機制探究首先,檢測不同代數(shù)的hUC-MSCs衰老程度與FOXQ1的蛋白表達(dá)量。其次,具體細(xì)胞分組分為P3-hUC-MSCs,P15-hUC-MSCs,P15-Vector-hUC-MSCs(病毒空載對照組),P15-FOXQ1-hUC-MSCs(病毒過表達(dá)組)。通過CCK-8檢測細(xì)胞增殖,SA-β-gal檢測細(xì)胞衰老。western blot與qPCR檢測衰老相關(guān)基因(P16、P21、P53、SIRT1、PCNA)表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化。熒光法鑒定細(xì)胞凋亡情況。Transwell小室檢測細(xì)胞遷移能力變化。最后,qPCR檢測不同組間加入SIRT1抑制劑EX527前后的衰老相關(guān)分泌表型(SASP,senescence associated secretory phenotype)水平變化(主要是IL-6、IL-8)。3、體內(nèi)實驗通過檢測FOXQ1過表達(dá)后的hUC-MSCs對APP+鼠的治療效果,反映過表達(dá)后hUC-MSCs在體內(nèi)條件下的存活與增殖能力的變化首先,體內(nèi)實驗分組,共計6組,分別是WT組(C57BL/6鼠,非治療對照組),APP+(非治療對照組),P3(P3代干細(xì)胞治療組),P15(P15代干細(xì)胞治療組),P15-Vector(P15代病毒空載干細(xì)胞治療組),P15-FOXQ1(P15代過表達(dá)FOXQ1干細(xì)胞治療組)。PCR鑒定APP+和WT鼠。取五月齡SPF級小鼠,每組10只,共計60只。經(jīng)過一個月干細(xì)胞注射治療后,通過莫氏水迷宮檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化。處死小鼠后,取血清檢測SOD含量。取全腦,免疫組化檢測小鼠海馬MAB1281表達(dá)情況。提取海馬蛋白,檢測衰老相關(guān)基因P16、P21、P53、SIRT1、SIRT2、PCNA,以及AD致病相關(guān)蛋白tau、p-tau(ser396),p-tau(ser235)的表達(dá)變化。結(jié)果1、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,符合hUC-MSCs表面抗原表達(dá)情況,不表達(dá)CD29(99.8%),CD90(99.5%),HLA-ABC(99.6%);高表達(dá)CD34(99.2%),CD45(99.9%),HLA-DR(99.6%)。FOXQ1過表達(dá)慢病毒重組載體構(gòu)建成功,FOXQ1過表達(dá)組hUC-MSCs的FOXQ1蛋白及mRNA表達(dá)水平較病毒空載組有極顯著升高(P0.01)。2、通過western blot與SA-β-gal檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著干細(xì)胞的衰老,FOXQ1的表達(dá)也隨之下降。CCK-8結(jié)果顯示,FOXQ1過表達(dá)組較空載組細(xì)胞增殖能力有顯著增強(P0.05),SA-β-gal染色結(jié)果提示,過表達(dá)組的藍(lán)染率較空載組明顯下降(P0.01)。蛋白水平檢測結(jié)果顯示,過表達(dá)組的衰老正相關(guān)蛋白p16(P0.01)、p21(P0.05)、p53(P0.05)表達(dá)均低于空載組,衰老負(fù)相關(guān)蛋白SIRT1(P0.01)、PCNA(P0.05)均明顯高于對照組。mRNA表達(dá)水平上P16(P0.05)、P21(P0.01)、P53(P0.05),SIRT1(P0.05)、PCNA(P0.05)的表達(dá)呈現(xiàn)出相同趨勢。FOXQ1過表達(dá)后,hUC-MSCs其增殖能力增強,但細(xì)胞仍會隨著代數(shù)增加而衰老,細(xì)胞分裂能力增強,并未達(dá)到無限增殖能力,傳代過程中未出現(xiàn)癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。在細(xì)胞遷移能力方面,FOXQ1過表達(dá)可以顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移能力。通過熒光法分析,FOXQ1可以顯著減少細(xì)胞凋亡。在SASP探究中,FOXQ1過表達(dá)組較空載組,其IL-6(P0.01),IL-8(P0.05)表達(dá)水平明顯較低。當(dāng)FOXQ1過表達(dá)組加入SIRT1抑制劑EX527后,其SASP表達(dá)水平上升,接近至空載組水平(P0.05)。3、各組小鼠水迷宮實驗結(jié)果顯示,FOXQ1過表達(dá)治療組的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力有著顯著提升,其逃避潛伏期,穿越平臺次數(shù),平臺象限停留時間均有明顯高于對照組(P0.05)。小鼠海馬MAB1281免疫組化染色結(jié)果顯示,FOXQ1過表達(dá)組的海馬區(qū)域細(xì)胞遷移率較對照組有顯著提升(P0.05),血清SOD含量明顯升高(P0.05)。小鼠海馬部分western blot檢測結(jié)果顯示,衰老正相關(guān)蛋白P21、P53,過表達(dá)組明顯低于對照組(P0.05),P16差異不顯著。衰老負(fù)相關(guān)蛋白SIRT1、SIRT2、PCNA,過表達(dá)組明顯高于對照組(P0.05)。AD致病相關(guān)蛋白,tau蛋白差異不顯著,對于磷酸化tau蛋白水平p-tau(ser396),p-tau(ser235)(P0.05),FOXQ1過表達(dá)組表達(dá)水平明顯低于對照組水平。結(jié)論1、臍帶分離的細(xì)胞符合hUC-MSCs表面抗原表達(dá)。FOXQ1慢病毒過表達(dá)載體系統(tǒng)可以有效提高其在hUC-MSCs中的表達(dá),蛋白水平及mRNA水平均有顯著提高。2、FOXQ1過表達(dá)后,使hUC-MSCs在體外增殖能力,遷移能力,抗衰能力明顯增強,未出現(xiàn)癌細(xì)胞特征;FOXQ1可通過SIRT1調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞衰老進(jìn)程。3、體內(nèi)條件下,FOXQ1過表達(dá)促進(jìn)了hUC-MSCs在小鼠腦內(nèi)的的存活能力與遷移能力。亦間接說明,FOXQ1過表達(dá)增強了hUC-MSCs抗衰能力。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R329.2

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本文編號：1336499