本文關(guān)鍵詞：MDV編碼的去泛素化酶UL36的活性及酶解特異性分析　出處：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：泛素化調(diào)節(jié)系統(tǒng)是真核細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的最重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng)之一,幾乎參與了細(xì)胞內(nèi)所有的生命過程。蛋白質(zhì)通過泛素化酶與去泛素化酶的催化實(shí)現(xiàn)泛素分子(Ub)在蛋白上的修飾與去修飾,從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的降解和功能上的變化。目前已發(fā)現(xiàn)的去泛素化酶可分為六個(gè)家族,其中泛素特異蛋白酶類(USP)包含的成員最多。研究發(fā)現(xiàn),很多病毒感染宿主后,能夠利用宿主的細(xì)胞表達(dá)自身編碼的去泛素化酶,并通過這些病毒的去泛素化酶干擾宿主細(xì)胞的泛素化調(diào)節(jié)系統(tǒng),從而控制宿主的免疫調(diào)節(jié),促進(jìn)病毒的復(fù)制和傳播。MDV編碼一種大被膜蛋白(UL36),長(zhǎng)約3000多個(gè)氨基酸,其N端結(jié)構(gòu)與USP類去泛素化酶相似,推測(cè)其具有去泛素化酶活性,MDV可能利用UL36的去泛素化酶活性影響宿主細(xì)胞,特別是T淋巴細(xì)胞的泛素調(diào)節(jié)系統(tǒng),從而促進(jìn)MDV病毒感染、誘導(dǎo)MD腫瘤發(fā)生以及影響宿主的免疫系統(tǒng)。然而,目前還未見有關(guān)MDV編碼的UL36活性的直接研究報(bào)道。本研究克隆了UL36的N端兩段DNA序列,應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)純化了UL36-323-strep、UL36-323-GST蛋白和UL36-480-GST三個(gè)蛋白。應(yīng)用不同類型的Ub類底物和類泛素底物分析了UL36蛋白的去泛素化酶活性和酶解特異性。結(jié)果表明,UL36具有去泛素化酶解活性,對(duì)K6、K11、K27、K29、K33、K48以及K63型泛素鏈都具有不同程度的水解活性,其中對(duì)K11、K48和K63型泛素鏈具有完全水解活性;三個(gè)UL36蛋白都能水解Ub4、Poly-Ub和Ub-PLA2底物;但對(duì)SUMO類底物和羅丹明標(biāo)記的類泛素NEDD8、FAT10、UAF1、ISG15底物均無水解活性。酶抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),高濃度(5×)的Roche公司的Complete Protease Inhibitor Cocktail可部分抑制UL36的活性;Ub特異性的抑制劑Ub-VS可完全抑制UL36活性,這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)UL36具有特異的水解Ub底物的去泛素化酶活性。為進(jìn)一步確定UL36去泛素化酶活性關(guān)鍵基團(tuán),我們經(jīng)過序列比對(duì)分析并根據(jù)其他病毒的相關(guān)報(bào)道,推測(cè)MDV編碼的UL36蛋白的第98位半胱氨酸和第234位組氨酸及其附近序列在各皰疹病毒中高度保守,并且類似于真核細(xì)胞中去泛素化酶的活性中心。為此,我們突變了C98和H234,表達(dá)純化了三個(gè)突變體蛋白UL36-480C98A-GST、UL36-480C98S-GST和UL36-480H234A-GST,并對(duì)其活性進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),三種突變體蛋白的去泛素化酶活性均有不同程度的下降,但并未完全消除。本研究通過兩種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化出MDV編碼的UL36蛋白,確定了UL36具有去泛素化酶活性,對(duì)不同泛素底都有水解活性,其中能完全水解K11、K48和K63型Ub鏈,但不能水解類泛素分子底物。推斷的保守活性中心的突變可降低UL36的去泛素化酶活性。本研究這些體外結(jié)果為進(jìn)一步研究UL36細(xì)胞內(nèi)功能,以及探索MDV的致病機(jī)制提供了重要的參考數(shù)據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78

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7 楊q，

本文編號(hào)：1319110