本文關(guān)鍵詞：樹舌靈芝FIP在畢赤酵母中的優(yōu)化表達及與赤靈芝、紫芝FIP的比較　出處：《沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白 重組表達 生物學(xué)活性 比較分析

【摘要】：真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(FIP)是近年來從高等真菌中發(fā)現(xiàn)的一類結(jié)構(gòu)與免疫球蛋白重鏈可變區(qū)相似的小分子蛋白,具有明顯的免疫調(diào)節(jié)、抗過敏、抗病毒、抗腫瘤等活性,且沒有任何毒副作用,具有開發(fā)成免疫調(diào)節(jié)劑和藥物的潛力。本論文主要由兩部分組成。第一部分為樹舌靈芝FIP基因的優(yōu)化、重組表達和生物學(xué)功能的驗證。為研究樹舌靈芝的活性成分及生物學(xué)功能,采用同源克隆的方法從樹舌靈芝子實體基因組中克隆出兩種樹舌靈芝FIPs基因(FIP-gap1和FIP-gap2)。根據(jù)畢赤酵母對密碼子使用的偏愛性,優(yōu)化FIP-ga即1/2基因,并在其C端添加組氨酸標簽序列,構(gòu)建重組表達載體pPIC9-His-FIP-gap1/2。利用畢赤酵母GS115高效重組表達FIP-gap1/2。SDS-PAGE 和 Western blot 結(jié)果表明,rFIP-gap1/2 大約在 14 KDa 和 17 KDa處有蛋白條帶,重組蛋白正確表達。rFIP-gap1/2在第4天的表達量最高,表達量分別達到207.4和157.5 mg/L,遠高于未經(jīng)優(yōu)化的FIP-gap1和FIP-gap2的表達量(2.66和4.56 mg/L)。rFIP-gap1/2經(jīng)過HIS TrapTM FF柱層析純化、透析和冷凍干燥,獲得純化的rFIP-gap1/2,并進行體外生物活性檢測。結(jié)果表明,rFIP-gap1在濃度為1μg/mL時就能夠凝集人、小鼠和羊的血細胞,而rFIP-gap2只有當(dāng)濃度達到8 μg/mL以上時才能凝集這三種血細胞;rFIP-gap1/2也都可以促進小鼠脾淋巴細胞增殖,且最佳作用濃度均為4μg/mL;除此之外,rFIP-gap1/2還能夠明顯地促進細胞因子IL-2和IFN-y的分泌,促進IL-2的表達量分別為622.5和416.5 pg/mL,而促進IFN-y的表達量分別為1381和1624 pg/mL;采用MTT法測定rFIP-gap1/2對A549、Hela和MCF-7三種癌細胞的抑制效果,結(jié)果表明,rFIP-gapl對A549、Hela和MCF-7三種細胞抑制效果較好,在濃度為32 μg/mL時,抑制率分別為 53.7%、82.9%和 82.5%,IC50值分別是 29.89%、8.34%和 12.19 μg/mL。同樣的濃度下,rFIP-gap2對A549和Hela細胞抑制效果不好,抑制率分別為13.9%和8.7%,IC50值分別為60.92和41.05μg/mL,而對MCF-7細胞的抑制效果較差,沒發(fā)現(xiàn)抑制作用。經(jīng)畢赤酵母的高效重組表達,成功的獲得具有生物學(xué)活性的rFIP-gap1/2。這為樹舌靈芝FIP進一步開發(fā)和實踐應(yīng)用提供理論依據(jù)。第二部分為rFIP-gap1/2、rLZ-8和rFIP-gsi的比較分析。人工合成LZ-8和FIP-gsi基因,構(gòu)建誘導(dǎo)型重組表達載體pPIC9-His-LZ-8和pPIC9-His-FIP-gsi,然后轉(zhuǎn)入畢赤酵母。經(jīng)SDS-PAGE和Western blot結(jié)果證明LZ-8和FIP-gsi成功表達,表達量分別為133.6和124.3 mg/L。重組蛋白經(jīng)組氨酸凝膠柱純化、透析、凍干處理后獲得純化的rLZ-8和rFIP-gsi,進行體外生物學(xué)活性檢測,并與rFIP-gap1/2的生物學(xué)功能進行比較分析。結(jié)果表明,當(dāng)rFIP-gap1、rLZ-8和rFIP-gsi的濃度為5 μg/mL時都能夠凝集人、小鼠和羊的血細胞,而rFIP-gap2在同樣的濃度下卻不能凝集這三種血細胞;rFIP-gap1/2、rLZ-8和rFIP-gsi(5 μg/mL)也都能夠明顯的促進小鼠脾淋巴細胞增殖,但作用效率不同;rLZ-8和rFIP-gsi(5 μg/mL)還能夠明顯地促進細胞因子IL-2和IFN-y的分泌,rLZ-8和rFIP-gsi促進脾淋細胞釋放IL-2的表達量分別為524.5和236.5 pg/mL。而促進脾淋細胞釋放IFN-γ的表達量分別達到了 606和1538 pg/mL;同時,采用MTT法測定rLZ-8和rFIP-gsi對A549、Hela和MCF-7三種癌細胞的抑制效果。rLZ-8在濃度為16 μg/mL時,對A549、Hela和MCF-7三種細胞抑制率分別為25.1%、33.9%和18.7%,IC50值分別為21.65、17.53和31.38 μg/mL。rFIP-gsi在濃度為16 μg/mL時,對Hela和MCF-7細胞的抑制率分別為23.7%和17.1%,而對A549、Hela和MCF-7三種細胞的IC50值分別68.04、19.44和39.89 μg/mL。rFIP-gap1/2與rLZ-8和rFIP-gsi的生物學(xué)活性比較分析,對進一步全面闡明FIP的生物學(xué)功能具有重要科學(xué)意義。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78;S567.3

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 馬紅霞;周忠波;包海鷹;圖力古爾;李玉;;樹舌靈芝中分離得到非還原性二糖—海藻糖(英文)[J];菌物學(xué)報;2008年04期

2 譚日紅;張翼伸;梁忠?guī)r;;長白山樹舌水溶性多糖的研究——F_T.F_A分離純化與結(jié)構(gòu)確定[J];東北師大學(xué)報(自然科學(xué)版);1991年04期

3 梁忠?guī)r,張翼伸,苗春艷;樹舌水溶色素多糖CF_2的結(jié)構(gòu)確定[J];生物化學(xué)雜志;1992年04期

4 梁忠?guī)r，苗春艷，張翼伸，張麗萍;樹舌多糖結(jié)構(gòu)修飾前后CD譜比較研究[J];生物化學(xué)雜志;1995年04期

5 葉玉娣;靈芝真?zhèn)沃鯷J];杭州科技;2001年02期

6 梁忠?guī)r,張翼伸,苗春艷;長白山樹舌水溶性色素多糖CF_1的分離純化與結(jié)構(gòu)研究[J];生物化學(xué)雜志;1990年03期

7 李麗秋,馬淑霞,楊景云,呂密凱,高艷華,車世偉;樹舌中藥復(fù)方煎劑對小鼠腸道菌群及體液免疫的調(diào)節(jié)作用[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;1997年06期

8 譚日紅;張翼伸;梁忠?guī)r;;長白山樹舌水溶性多糖研究—F_B·F_C的分離純化與結(jié)構(gòu)確定[J];東北師大學(xué)報(自然科學(xué)版);1993年03期

9 梁忠?guī)r，，譚日紅，張翼伸，苗春艷;樹舌多糖Fb、Fc的結(jié)構(gòu)研究[J];生物化學(xué)雜志;1994年04期

10 梁忠?guī)r，張翼伸，苗春艷，張麗萍;樹舌多糖CF2a溶液中構(gòu)象行為的研究[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報;1994年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 李忠譜;;野生活樹樹舌與栽培靈芝藥效比較研究[A];中國自然資源學(xué)會全國第二屆天然藥物資源學(xué)術(shù)研討會論文集[C];1997年

2 張凌凌;潘景芝;王琦;;樹舌菌絲體多糖提取工藝研究[A];中國菌物學(xué)會2009學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2009年

3 于英君;李麗陽;宋高臣;管宇;;樹舌多糖GF注射液對環(huán)磷酰胺的增效減毒作用[A];2007年全國生化與生物技術(shù)藥物學(xué)術(shù)年會論文集[C];2007年

4 劉海良;宋愛榮;黃芳;;樹舌靈芝MP-01菌株發(fā)酵液靈芝酸的提取及測定[A];2008全國藥用真菌學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

5 于英君;劉春玲;;重組siRNA/CDK2對HO-8910抑制及樹舌多糖GF協(xié)同作用的研究[A];現(xiàn)代化中藥制劑發(fā)展與中藥藥理學(xué)研究交流會論文集[C];2009年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 曾憲策 羅欣;“樹舌”豈能充“靈芝”[N];醫(yī)藥導(dǎo)報;2006年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 焦連慶;樹舌多糖分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其生物活性研究[D];長春中醫(yī)藥大學(xué);2010年

2 于赫;樹舌多糖GF對小鼠HepA瘤細胞可溶性蛋白質(zhì)組及核蛋白MDM-2表達的影響[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2006年

3 于曉光;纖粘連蛋白誘導(dǎo)Hela細胞轉(zhuǎn)移機制及樹舌多糖（GF）抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的實驗研究[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2003年

4 宋高臣;RNAi沉寂肝癌細胞CDK2基因表達及樹舌多糖GF輔助作用的研究[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2008年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 段作文;樹舌靈芝FIP在畢赤酵母中的優(yōu)化表達及與赤靈芝、紫芝FIP的比較[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

2 臧金平;樹舌菌株的分離、鑒定及培養(yǎng)研究[D];南京師范大學(xué);2005年

3 楊顏銘;樹舌多糖雙向免疫調(diào)節(jié)作用的研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

4 林倩倩;樹舌靈芝深層發(fā)酵及三萜類化合物的研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

5 宋高臣;樹舌多糖GF注射液對化療藥物環(huán)磷酰胺增效減毒作用的實驗研究[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2005年

6 崔太浩;樹舌多糖抗實驗性胃潰瘍作用及其作用機制研究[D];延邊大學(xué);2008年

7 曹艷菲;移植H_（22）小鼠血清蛋白質(zhì)組及樹舌多糖GF注射液對其影響的研究[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2007年

8 周忠波;樹舌靈芝化學(xué)成分及體外抗腫瘤活性研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

9 劉小臘;樹舌靈芝液體深層發(fā)酵浸膏多糖的抗腫瘤活性研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

10 張春玉;長白山藥用真菌樹舌凝集素的分離純化及生化特性[D];東北師范大學(xué);2005年

本文編號：1318709