本文關(guān)鍵詞：人參糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT-D-3OH-1的克隆及原核表達(dá)　出處：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：人參作為人參屬植物的代表,在中國(guó)已有上千年的應(yīng)用歷史,是傳統(tǒng)的名貴中草藥,為五加科多年生草本植物。人參皂苷是人參乃至人參屬植物的主要活性成分,存在于人參的根、莖、葉等部位。人參皂苷Rh2是一種具有很高藥用價(jià)值的單體人參皂苷,尤其在腫瘤的預(yù)防及治療方面有著廣泛的應(yīng)用,但人參皂苷Rh2的生產(chǎn)工藝一直未取得突破。研究表明人參皂苷Rh2由一系列的代謝合成,經(jīng)歷角鯊烯,2,3-氧化角鯊烯,達(dá)瑪烯二醇,原人參二醇,最終原人參二醇在糖基轉(zhuǎn)移酶UGT-D-3OH-1的催化作用下生成人參皂苷Rh2。目前原人參二醇已經(jīng)可以通過(guò)發(fā)酵法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),本研究旨在利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),構(gòu)建糖基轉(zhuǎn)移酶UGT-D-3OH-1的原核表達(dá)工程菌,利用原核表達(dá)系統(tǒng)的高效表達(dá)特性,通過(guò)發(fā)酵法生產(chǎn)糖基轉(zhuǎn)移酶UGT-D-3OH-1,以實(shí)現(xiàn)用酶工程的方法轉(zhuǎn)化原人參二醇生成人參皂苷Rh2。本研究通過(guò)基因工程的方法,以實(shí)驗(yàn)室繼代培養(yǎng)的人參發(fā)根為實(shí)驗(yàn)材料,克隆得到了人參發(fā)根中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT-D-3OH-1,將該基因與原核表達(dá)載體pET-22b(+)和pET-28a(+)分別進(jìn)行連接,得到的重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)入宿主菌E.coli BL21(DE3),得到原核表達(dá)工程菌BL21-UGT-22b和BL21-UGT-28a。工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),目的蛋白SDS-PAGE電泳檢測(cè),包涵體復(fù)性,酶活測(cè)定,最終得到了具有酶活的目的蛋白,在體外以原人參二醇為底物通過(guò)酶催化反應(yīng)生成人參皂苷Rh2,并進(jìn)一步地對(duì)工程菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)人參皂苷Rh2奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究的主要內(nèi)容如下:(1)以培養(yǎng)了28d的人參發(fā)根為實(shí)驗(yàn)材料,提取獲得了人參發(fā)根的總RNA,通過(guò)RT-PCR技術(shù)反轉(zhuǎn)錄出人參的c DNA,根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的序列以及引入酶切位點(diǎn)的需求,設(shè)計(jì)UGT-D-3OH-1基因的特異性引物,再以c DNA為模板,最終成功克隆出了糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT-D-3OH-1。(2)將糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT-D-3OH-1與pMD18-T克隆載體相連接,構(gòu)建得到的重組載體命名為pT-UGT,之后再將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中JM109中,經(jīng)過(guò)菌液PCR鑒定和雙酶切鑒定,初步認(rèn)定構(gòu)建成功,進(jìn)一步測(cè)序顯示成功構(gòu)建了重組載體pT-UGT。(3)用BamHI和Sal I兩個(gè)酶對(duì)克隆載體pT-UGT和原核表達(dá)載體pET-22b(+)和pET-28a(+)分別進(jìn)行酶切,使用T4 DNA連接酶將UGT-D-3OH-1基因與原核表達(dá)載體pET-22b(+)和pET-28a(+)分別相連接,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-22b-UGT和pET-28a-UGT,通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證了載體上的目的基因序列正確。將兩種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中,最終構(gòu)建了兩種原核表達(dá)工程菌BL21-UGT-22b和BL21-UGT-28a。(4)對(duì)構(gòu)建成功的兩種工程菌分別進(jìn)行培養(yǎng),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)工程菌中目的蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果表明目的蛋白在兩種工程菌中均有表達(dá),都是以不可溶的包涵體形式表達(dá),在工程菌BL21-UGT-22b中表達(dá)的目的條帶分子量約為50 KDa,比UGT-D-3OH-1的預(yù)測(cè)分子量少了5 KDa,在工程菌BL21-UGT-28a中表達(dá)的目的條帶與UGT-D-3OH-1的預(yù)測(cè)分子量一致,大小為55 KDa。(5)對(duì)工程菌BL21-UGT-28a中以包涵體形式表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行復(fù)性,復(fù)性后加入底物進(jìn)行酶促反應(yīng),通過(guò)HPLC檢測(cè)到了反應(yīng)產(chǎn)物人參皂苷Rh2,含量為6.657×10~(-3) mg/L,說(shuō)明包涵體復(fù)性后具有了正常的酶活,酶活大小為1.78×10~(-4) U/m L。(6)從初始誘導(dǎo)OD600nm值,IPTG濃度,誘導(dǎo)時(shí)間,誘導(dǎo)溫度四個(gè)方面對(duì)工程菌BL21-UGT-28a的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,確定了最佳發(fā)酵條件為:初始誘導(dǎo)OD600nm值0.8,IPTG濃度0.1 m M,誘導(dǎo)時(shí)間6 h,誘導(dǎo)溫度37℃,在此條件下目的蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白表達(dá)量的比例為53.5%。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2

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1 孫軍;;淺談原核表達(dá)的技巧[J];大學(xué)時(shí)代;2006年07期

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4 朱向前;楊靜;丁曉然;王升啟;;重組人磷脂爬行酶1的原核表達(dá)及純化[J];生物技術(shù)通訊;2011年06期

5 哲名家;張淼濤;云濤;王玢tx;劉光清;;兔巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆與原核表達(dá)[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2012年04期

6 謝海燕,郭霄峰;豬α-干擾素的原核表達(dá)[J];華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2004年04期

7 孫東波;馮力;劉杰;時(shí)洪艷;佟有恩;劉勝旺;童光志;;豬傳染性胃腸炎病毒n基因的原核表達(dá)及重組蛋白的免疫活性分析[J];病毒學(xué)報(bào);2006年02期

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9 戴華;鄭佳玉;陳俊華;潘志明;焦新安;;雞α干擾素基因的原核表達(dá)及其活性測(cè)定[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2009年10期

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1 馬文濤;閆若潛;吳志明;劉光輝;盛敏;謝彩華;;豬白細(xì)胞介素-6的原核表達(dá)及其生物學(xué)活性研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)——第二屆中國(guó)獸醫(yī)臨床大會(huì)論文集(下冊(cè))[C];2010年

2 丁夢(mèng)蝶;魯?shù)?王紅寧;田浪;陽(yáng)泰;張毅;樊汶樵;郭自成;;禽傳染性支氣管炎病毒多基因串聯(lián)表位抗原的原核表達(dá)研究[A];四川省動(dòng)物學(xué)會(huì)第九次會(huì)員代表大會(huì)暨第十屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

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1 張曉鳴;人IL-16的原核表達(dá)與其功能的初步研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2000年

2 曹秀利;楊樹(shù)PtCDD基因的原核表達(dá)及酶活分析[D];南京林業(yè)大學(xué);2008年

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6 尹國(guó)華;利用Red重組系統(tǒng)構(gòu)建dsRNA原核表達(dá)體系抗煙草花葉病毒的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

7 韓凌霞;豬圓環(huán)病毒2型基因的原核表達(dá)與單克隆抗體的制備及感染性分子克隆的動(dòng)物接種試驗(yàn)[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2003年

8 于揚(yáng);重組人源GPx4及其模擬物的原核表達(dá)、結(jié)構(gòu)與功能的研究[D];吉林大學(xué);2013年

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1 周鵬;結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白的原核表達(dá)、純化及免疫原性分析[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

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10 姜旭;百合無(wú)癥病毒16kDα基因的克隆、原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位[D];大連理工大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：1310348