本文關(guān)鍵詞：海棲熱袍菌中嗜熱酶基因的克隆及發(fā)酵條件優(yōu)化

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【摘要】：二十一世紀(jì),開發(fā)和利用海洋生物資源已成為全球關(guān)注點之一,對極端海洋環(huán)境微生物的研究也上了一個新層次。因此對極端酶的研究也廣泛引起了海內(nèi)外專家的興趣,尤其嗜熱酶已經(jīng)在許多領(lǐng)域有了較好的應(yīng)用。海棲熱袍菌(Thermotoga maritime)是一種來源于深�；鹕降臉O端嗜熱菌,生長環(huán)境特殊難以大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng),其酶資源用于工業(yè)化生產(chǎn)十分困難。使用基因工程手段對極端環(huán)境微生物的酶基因加以克隆并進(jìn)行高效表達(dá),是目前利用極端環(huán)境微生物酶資源的主要方法。本課題主要研究了海棲熱袍菌表達(dá)的內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶(TM1525)、阿拉伯內(nèi)切-1,4-β-半乳聚糖酶(TM1201)、磷酸戊糖變位酶(TM1067)三種嗜熱酶。采用基因克隆技術(shù)構(gòu)建表達(dá)嗜熱酶的基因工程菌,通過層析柱處理加以純化成功表達(dá)的外源蛋白酶,已有文獻(xiàn)報道嗜熱磷酸戊糖變位酶(PPM)的主要酶活性質(zhì),因此本文應(yīng)用響應(yīng)面法對工程菌發(fā)酵產(chǎn)PPM的條件進(jìn)行優(yōu)化。本文的主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1.以海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)基因組為模板,根據(jù)內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶、阿拉伯內(nèi)切-1,4-β-半乳聚糖酶、磷酸戊糖變位酶三種嗜熱酶基因序列設(shè)計引物,質(zhì)粒p ET-32a(+)為表達(dá)載體,E.coli BL21(DE3)為表達(dá)菌株,成功構(gòu)建表達(dá)海棲熱袍菌嗜熱酶的三種工程菌。2.研究三種工程菌的生長曲線,以IPTG為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),通過聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白免疫印跡等方法進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶、阿拉伯內(nèi)切-1,4-β-半乳聚糖酶未在工程菌中成功表達(dá),磷酸戊糖變位酶成功表達(dá)。3.運用生物信息學(xué)軟件,對成功表達(dá)的目的蛋白酶理化性質(zhì)進(jìn)行分析;采用Ni-NTA樹脂層析柱對目的蛋白進(jìn)行純化,結(jié)果顯示可以得到電泳純的磷酸戊糖變位酶。4.通過Plackett-Burman設(shè)計、最陡爬坡試驗和Box-Behnken試驗設(shè)計構(gòu)建回歸方程對磷酸戊糖變位酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示,最佳發(fā)酵條件為誘導(dǎo)種齡OD600 0.6,誘導(dǎo)溫度22.5℃,誘導(dǎo)時間13h,IPTG濃度0.45m M,培養(yǎng)基p H7.6,接種量2.25%。在此條件下磷酸戊糖變位酶表達(dá)量較初始發(fā)酵條件提高了約1.53倍。
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：TQ925;Q78

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本文編號：1305055