發(fā)布時(shí)間：2017-12-18 04:04

  本文關(guān)鍵詞：組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Mof在向成骨細(xì)胞分化中的作用

  更多相關(guān)文章： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 Mof 向成骨細(xì)胞分化 Runx2

【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone MesenchymalStem Cells,BMSCs)是一種來(lái)自骨髓的多能干細(xì)胞,自我更新能力強(qiáng),具有多向分化的潛能。體內(nèi)正常生長(zhǎng)或體外定向誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下,它可以向成骨細(xì)胞,軟骨細(xì)胞,脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞分化。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用包括骨缺損,軟骨退化的治療,肝臟、心臟等組織修復(fù),新陳代謝相關(guān)疾病治療。在再生醫(yī)學(xué)與組織工程中其臨床應(yīng)用價(jià)值很高。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化有兩條主要的調(diào)控途徑,分別是TGF-β/BMPs信號(hào)通路和經(jīng)典Wnt信號(hào)通路。Bmp2作為BMPs家族中一個(gè)重要的亞型,它與來(lái)自Wnt信號(hào)通路中的β-catenin都具有上調(diào)向成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因Runx2,Osterix表達(dá)的功能,從而促進(jìn)向成骨細(xì)胞分化。Mof即KAT8,作為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶MYST家族的成員,它具有MYST催化結(jié)構(gòu)域。大多數(shù)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶家族往往隨機(jī)對(duì)組蛋白尾部賴氨酸進(jìn)行乙�；�,Mof對(duì)組蛋白H4第16位的賴氨酸具有嚴(yán)格的底物特異性。Mof在許多以染色質(zhì)為基礎(chǔ)的生命活動(dòng)中發(fā)揮調(diào)控作用,如胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、DNA損傷修復(fù)以及腫瘤發(fā)生。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的這一過(guò)程,組蛋白乙�；{(diào)控發(fā)揮著重要功能。成骨分化相關(guān)蛋白R(shí)unx2在向成骨細(xì)胞分化進(jìn)程中表達(dá)升高,這與H3K9的乙�；揎椇虷3K14的乙�；揎椨嘘P(guān)。HDAC8可以抑制H3K9乙�；蚏unx2活性,抑制成骨分化。組蛋白白去乙�；敢种苿┛梢源龠M(jìn)向成骨細(xì)胞分化。了解Mof在向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮的作用將有重要的研究意義與臨床實(shí)用價(jià)值。研究目的:我們利用小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞ST2細(xì)胞,前成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化,分別通過(guò)堿性磷酸酶染色實(shí)驗(yàn),茜素紅染色實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,研究Mof在向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)變化情況。我們利用siRNA干擾Mof表達(dá)后,觀察向成骨細(xì)胞分化是否受到抑制。利用Western Blotting實(shí)驗(yàn)和定量PCR(Q-PCR)技術(shù)檢測(cè)干擾Mof表達(dá)和過(guò)表達(dá)Mof后,Bmp2、β-catenin、Runx2、Osterix的蛋白和RNA的表達(dá)變化情況。免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)探究Mof和向成骨細(xì)胞分化相關(guān)蛋白之間的相互作用。研究方法:1.配制誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基培養(yǎng)ST2細(xì)胞,MC3T3-E1細(xì)胞從而誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化,利用堿性磷酸酶染色實(shí)驗(yàn)以及茜素紅染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。利用 Western Blotting 技術(shù)檢測(cè) Mof、H4K16ac 以及 Bmp2、β-catenin、Runx2和Osterix在誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化0天,3天,7天和14天的蛋白表達(dá)變化情況。2.在ST2細(xì)胞,MC3T3-E1細(xì)胞中利用siRNA干擾Mof的表達(dá),觀察向成骨細(xì)胞分化是否在Mof的表達(dá)降低時(shí)受到抑制,利用WesternBlotting實(shí)驗(yàn)和 Q-PCR 實(shí)驗(yàn)觀察 Bmp2、β-catenin、Runx2 和 Osterix 等在 Mof 表達(dá)降低時(shí)的表達(dá)變化。3.在ST2細(xì)胞,MC3T3-E1細(xì)胞中,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Flag-Mof質(zhì)粒,研究在過(guò)表達(dá) Mof 時(shí),Bmp2、β-catenin、Runx2 和 Osterix 的表達(dá)變化。4.利用Co-IP實(shí)驗(yàn)方法觀察正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)情況下ST2細(xì)胞,MC3T3-E1細(xì)胞中,Mof與Runx2、Osterix和β-catenin的相互作用關(guān)系。5.在全身敲除Mof的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中,利用HE染色方法觀察骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.ST2細(xì)胞,MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化后,Mof蛋白的表達(dá)水平,H4K16乙酰化水平隨著天數(shù)增加逐漸升高。Bmp2、β-catenin、Runx2、Osterix的蛋白表達(dá)也升高。2.利用siRNA干擾Mof的表達(dá)后,向成骨細(xì)胞分化受到抑制。Bmp2、β-catenin的表達(dá)沒(méi)有明顯變化,Runx2、和Osterix的表達(dá)降低。3.過(guò)表達(dá)Mof后,Runx2和Osterix的蛋白表達(dá)升高。4.Co-IP實(shí)驗(yàn)證明,Mof并不與β-catenin相互作用,但是和Runx2、Osterix相互作用。5.小鼠個(gè)體水平的研究發(fā)現(xiàn),全身敲除Mof后,骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)并沒(méi)有明顯變化,可能誘導(dǎo)天數(shù)較短,表型變化并不明顯。結(jié)論:向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中,Mof蛋白表達(dá)量升高。干擾Mof表達(dá)造成向成骨細(xì)胞分化受到抑制。Mof可以與Runx2、Osterix在蛋白水平上相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明向成骨細(xì)胞分化這一過(guò)程中Mof具有重要的調(diào)控作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R329.2

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