本文關(guān)鍵詞：曼氏無針烏賊NPYR-like基因克隆及表達分析

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【摘要】：曼氏無針烏賊(Sepiella japonica)是我國重要的海洋經(jīng)濟物種,現(xiàn)人工養(yǎng)殖發(fā)展迅速,但隨之出現(xiàn)性早熟、個體偏小等現(xiàn)象,嚴重影響其養(yǎng)殖效益。因此研究烏賊生長及生殖發(fā)育調(diào)控機制是解決這一問題的關(guān)鍵。神經(jīng)肽Y受體(Neuropeptide Y receptor,NPYR)是典型的G蛋白偶聯(lián)受體,在許多動物的攝食生長和發(fā)育繁殖中扮演著重要角色。本論文采用分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)等實驗方法,分析曼氏無針烏賊神經(jīng)肽Y-like(Sepiella japonica NPYR-like,Sj NPYR-like)基因的序列特征、受體類型、亞細胞定位、組織分布特征、在攝食中的調(diào)控功能及在生長周期中的變動規(guī)律。主要取得的研究結(jié)果如下:采用RACE克隆技術(shù)獲得了Sj NPYR-like的全長序列,并對其序列特征進行了分析,結(jié)果表明,Sj NPYR-like c DNA序列(KX683395)全長1,902 bp,包含492 bp的5'UTR、228 bp的3'UTR和1,182 bp的ORF,可編碼393個氨基酸。與其他G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)類似,Sj NPYR-like擁有七個跨膜結(jié)構(gòu)域TM1(AA36-58)、TM2(AA79-101)、TM3(AA111-133)、TM4(AA145-167)、TM5(200-222)、TM6(AA254-271)和TM7(AA286-308)。利用系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn),Sj NPYR-like與脊椎動物中神經(jīng)肽Y受體(Neuropeptide Y receptor,NPYR)的三支亞型(NPYR-1、NPYR-2和NPYR-5)具有同源性,與無脊椎動物中神經(jīng)肽F受體(Neuropeptide F receptor,NPFR)聚為一支。經(jīng)多序列比對發(fā)現(xiàn),其與預(yù)測的真鞘NPYR序列同源性高達81%。利用細胞生物學(xué)研究方法,對Sj NPYR-like受體細胞定位進行分析,結(jié)果表明,通過構(gòu)建Sj NPYR-EGFP表達載體,轉(zhuǎn)染至HEK293細胞中,用熒光染料Di I染膜、DAPI染核,在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Sj NPYR-like定位于細胞膜上,與Sj NPYR-like序列中存在七次跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果相一致,表明Sj NPYR-like是一個膜受體,為下一步功能驗證奠定了基礎(chǔ)。通過熒光定量PCR技術(shù)分析了Sj NPYR-like m RNA在不同生殖階段曼氏無針烏賊組織中的表達特征。結(jié)果表明,Sj NPYR-like基因在曼氏無針烏賊腦、性腺和肝等組織中有較高的表達量,在其他組織中表達量相對較低。Sj NPYR-like的表達在曼氏無針烏賊的生長發(fā)育周期中存在明顯的變化;在卵原細胞階段、原生質(zhì)生長階段和間質(zhì)生長階段,Sj NPYR-like表達量在卵子發(fā)生過程中顯著上升(P0.05),到發(fā)育成熟階段即營養(yǎng)質(zhì)生長階段Sj NPYR-like表達量則顯著下降。Sj NPYR-like表達量變化特征研究結(jié)果說明其在烏賊生殖發(fā)育中可能具有一定的調(diào)控功能。綜上所述,本論文克隆了曼氏無針烏賊NPYR-like基因,并對其亞細胞定位和生理實驗做了初步的研究,為進一步研究曼氏無針烏賊神經(jīng)肽受體信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)機制以及生理功能奠定了基礎(chǔ),并為解決人工養(yǎng)殖條件下曼氏無針烏賊個體小、性早熟等問題提供了一定的理論參考。
【學(xué)位授予單位】：浙江海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4;Q78

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