本文關(guān)鍵詞：磁性核—?dú)ど锔叻肿蛹{米顆粒的制備及用于β-葡萄糖苷酶（CfGlu1B）的分離純化和活性改進(jìn)

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【摘要】：本研究合成了一種“核-殼”結(jié)構(gòu)的磁性生物高分子納米顆粒,將其用于分離純化融合蛋白及改良蛋白的活性。以帶六聚組氨酸標(biāo)簽的CfGlu1B(臺(tái)灣家白蟻三種內(nèi)源性β-葡萄糖苷酶中的一種)為對(duì)象,研究了該磁性納米顆粒在分離純化CfGlu1B和改進(jìn)酶活性方面的應(yīng)用,結(jié)果如下:(1)通過蒸餾沉淀聚合法制備的磁性納米顆粒Fe_3O_4/PMG/IDA-Ni~(2+),通過透射電子顯微鏡(TEM)、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)、熱重分析儀(TGA)、X射線衍射儀(X-ray)以及強(qiáng)磁場(chǎng)震動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)表征磁性納米顆粒的形態(tài)結(jié)構(gòu)、組成和磁性能等理化特征。結(jié)果顯示Fe_3O_4/PMG/IDA-Ni~(2+)為“核-殼”結(jié)構(gòu),直徑約為350 nm;相應(yīng)官能團(tuán)的特征吸收峰明顯;飽和磁化量為20.7emu/g,對(duì)外加磁場(chǎng)響應(yīng)靈敏。(2)研究磁性納米顆粒在分離純化融合蛋白CfGlu1B(His-Cf Glu1B)方面的應(yīng)用。首先確定帶His標(biāo)簽的CfGlu1B融合蛋白和磁性納米顆粒的特異性結(jié)合,對(duì)比目標(biāo)磁性納米顆粒以及中間產(chǎn)物顆粒分別與含His-CfGlu1B蛋白的溶液孵育后的SDS-PAGE和溶液中剩余酶活的變化,確定了His-CfGlu1B特異性結(jié)合目標(biāo)磁性納米顆粒,不會(huì)與中間產(chǎn)物顆粒發(fā)生非特異性吸附;其次比較該磁性納米顆粒與商業(yè)化純化材料的純化效率的差異,選取兩種商業(yè)化純化材料(GenScript)無磁性鎳柱High Affinity Ni-NTA Resin和(Thermo Scientific)磁性鎳柱HisPurTM Ni-NTA Magnetic Beads,純化后His-CfGlu1B的比活和總活力回收率結(jié)果顯示三種材料的純化效率相當(dāng),純化后CfGlu1B的比活如下:無磁性鎳柱(45.09 U/mg)略大于磁性納米顆粒(42.61 U/mg),略高于磁性鎳柱(40.86 U/mg);蛋白CfGlu1B的總活力回收率如下:無磁性鎳柱(77.3%)大于磁性鎳柱(63.2%),高于磁性納米顆粒(60.6%)。(3)研究磁性納米顆粒作為固定化酶載體對(duì)酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。研究了固定化過程的三個(gè)主要影響因素:His-CfGlu1B蛋白量/載體(μg/mg)、孵育時(shí)間和孵育溫度。三個(gè)因素分別對(duì)固定化His-CfGlu1B活性作曲線,得出固定化最佳條件:蛋白量/載體是120μg,孵育時(shí)間30 min,孵育溫度25℃。在最佳條件下測(cè)定磁性納米顆粒的固載量約為60 mg/g。固定化對(duì)His-CfGlu1B動(dòng)力學(xué)參數(shù)影響的研究結(jié)果表明,固定化His-CfGlu1B(Km=3.4±0.4 mM)對(duì)底物p-NPG的親和力高于游離的(Km=4.2±0.3 mM),固定化His-CfGlu1B的催化效率(Kcat/Km=13.5±0.7 S-1 mM-1)略低于游離的(Kcat/Km=14.0±0.7 S-1 mM-1)。(4)研究磁性納米顆粒作為固定化載體在活性改良方面的應(yīng)用價(jià)值。首先研究載體和His-CfGlu1B酶的結(jié)合穩(wěn)定性,固定化的酶在4℃放置20天后未能檢測(cè)到載體和His-CfGlu1B酶的分離,說明His-CfGlu1B酶與磁性納米顆粒間的結(jié)合穩(wěn)定。其次研究固定化酶的熱穩(wěn)定性,固定化His-CfGlu1B在60℃溫育30分鐘后,殘留活性是原活性的75%,而游離His-CfGlu1B在60℃溫育30分鐘后,殘留活性檢測(cè)不到;固定化His-CfGlu1B在25℃放置20天后酶活剩余70%,而游離His-CfGlu1B在25℃放置20天后酶活剩余20%,這說明固定化His-CfGlu1B的熱穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于游離的酶。最后檢測(cè)了固定化His-CfGlu1B酶可重復(fù)使用次數(shù),固定化酶在11次重復(fù)使用后仍維持約70%的原酶活性,改善了游離酶難以重復(fù)利用的缺點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TB383.1;Q814.1

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本文編號(hào)：1291989