本文關(guān)鍵詞：豬δ冠狀病毒重組N蛋白間接ELISA抗體檢測方法的建立與評價

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【摘要】：豬δ冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一種以引起仔豬腹瀉、嘔吐以及脫水為特征的豬腸道傳染病病毒。2012年,Woo等首次在我國香港的豬群中發(fā)現(xiàn)PDCoV,隨后該病于2014年2月在美國暴發(fā)。據(jù)報道,在我國的江西、安徽、江蘇、湖北、哈爾濱等地區(qū)的部分豬場中檢測到PDCoV,該病毒已經(jīng)成為嚴重影響我國豬群健康的新發(fā)病原體。因此,建立一種快速、準確的血清學(xué)診斷方法,對PDCoV進行血清學(xué)調(diào)查是非常必要的。冠狀病毒的N蛋白高度保守,因此本研究選擇PDCoV N蛋白作為診斷抗原。為了獲得PDCoV N蛋白,本研究根據(jù)Genbank發(fā)表的PDCoV N基因的核苷酸序列,根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏嗜性,人工合成了PDCo V N基因。合成的基因分別連接至pET-32a和pGEX-6p-1原核表達載體,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達,成功獲得了重組蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N,經(jīng)鑒定重組蛋白均為可溶性蛋白。Western blot結(jié)果顯示,重組蛋白均能被PDCoV陽性血清識別,具有良好的抗原性,能夠作為檢測PDCoV抗體的診斷抗原。為了建立檢測PDCoV抗體的血清學(xué)診斷方法,本研究以純化的重組蛋白pET-32a-PDCoV-N作為診斷抗原建立了檢測PDCoV抗體的間接ELISA方法(rPDCoV-N-ELISA)。本研究通過反應(yīng)條件優(yōu)化、cut-off值的確定、特異性試驗、重復(fù)性試驗以及ROC曲線分析進行了rPDCoV-N-ELISA可行性評價。試驗結(jié)果表明,rPDCoV-N-ELISA的最佳抗原包被濃度為1μg/mL,最佳一抗稀釋度為1/200,最佳二抗稀釋度為1/7 500,最佳抗體孵育時間為均為1 h。特異性試驗表明,該抗原不與其他常見7種豬病的陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)。重復(fù)性試驗得出,批間批內(nèi)重復(fù)性試驗的變異系數(shù)均小于15%。ROC曲線分析得出,與western blot相比,該方法的敏感性和特異性分別為100%和90.4%。上述試驗結(jié)果表明,rPDCoV-N-ELISA具備檢測PDCoV抗體的可行性。本實驗室利用rPDCoV-N-ELISA對收集自黑龍江省部分地區(qū)的319份豬血清樣本進行血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),樣本的PDCoV抗體總陽性率為11.59%(37/319),表明該病在黑龍江省部分地區(qū)呈現(xiàn)較低的流行性。本研究獲得的PDCoV重組蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N均可以被PDCoV陽性血清識別,可以作為檢測PDCoV抗體的診斷抗原。本研究利用重組蛋白pET-32a-PDCoV-N建立的檢測PDCo V抗體的間接ELISA方法,與western blot相比,具有較高的敏感性和特異性,可以為PDCoV流行病學(xué)調(diào)查提供一種快速、簡便的血清學(xué)診斷方法。
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.651

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本文編號：1291474