本文關(guān)鍵詞：家蠶DNA聚合酶δ復(fù)合物的表達(dá)、純化和酶學(xué)特性分析

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【摘要】：作為鱗翅目類昆蟲的代表,家蠶是研究農(nóng)業(yè)及林業(yè)類害蟲防治優(yōu)先考慮的生物模型,也是研究動物細(xì)胞分化、生長、遺傳和變異的重要模式生物之一。利用家蠶幼體作為一種生物反應(yīng)器,可以低成本和大規(guī)模地獲取外源蛋白。真核生物DNA聚合酶δ一般是多亞基蛋白復(fù)合物,例如高等哺乳動物DNA聚合酶δ多由四亞基組成,昆蟲DNA聚合酶δ多由三亞基組成。真核生物DNA聚合酶δ是非常重要的復(fù)制型DNA聚合酶,具有持續(xù)合成DNA的能力,其3’-5’核酸外切酶活性保證復(fù)制的高保真度,并且在調(diào)節(jié)細(xì)胞正常代謝以及保證基因組完整性和穩(wěn)定性等方面發(fā)揮重要的作用。本研究基于MultiBac系統(tǒng)表達(dá)家蠶DNA聚合酶δ復(fù)合物。通過與人(Homo sapiens)DNA聚合酶δ基因的生物信息學(xué)比對分析,從家蠶數(shù)據(jù)庫(GenBank)中獲取家蠶DNA聚合酶δ復(fù)合物三個亞基的基因序列。從家蠶五齡幼蟲的血淋巴中提取總RNA,經(jīng)RT-PCR反應(yīng)得到cDNA。根據(jù)生物信息學(xué)比對分析結(jié)果設(shè)計引物并以cDNA為模板分別PCR得到三個亞基的基因,分別為Bmpol-1、Bmpol-2及Bmpol-3。然后分別制備pFast BacHTb-Bmpol-1和pUCDM-Bmpol-2/3兩個重組質(zhì)粒。輔助質(zhì)粒pMon7124表達(dá)的轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)pFastBacHTb-Bmpol-1和Bacmid在E.coli細(xì)胞內(nèi)發(fā)生Tn7轉(zhuǎn)座反應(yīng),通過藍(lán)白斑篩選及抗性篩選得到Bcmid Bmpol-1重組受體。pBADZHis6Cre質(zhì)粒表達(dá)的Cre重組酶介導(dǎo)pUCDM-Bmpol-2/3與Bacmid Bmpol-1在Cre-loxP位點發(fā)生特異性重組,得到Bacmid Bmpol-1/2/3重組質(zhì)粒。將重組Bacmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf-9細(xì)胞制備重組病毒。從感染的細(xì)胞中提取RNA,經(jīng)RT-PCR反應(yīng)檢測到Bmpol-1、Bmpol-2及Bmpol-3基因在細(xì)胞內(nèi)均發(fā)生轉(zhuǎn)錄。Western blot雜交實驗表明,家蠶DNA聚合酶δ復(fù)合物BmPOL-1及BmPOL-3蛋白亞基均在Sf-9細(xì)胞中表達(dá)(目前還沒有BmPOL-2蛋白亞基抗體,因此并未做BmPOL-2亞基Western blot雜交實驗)。poly(d A)/oligo(dT)酶活性檢測實驗表明,單獨的Bmpol-1大亞基不能催化合成DNA,而三亞基復(fù)合物能催化DNA合成,顯示出酶學(xué)活性。使用Strep-Tactin和Ni2+-NTA親和層析柱大量純化得到家蠶DNA聚合酶δ復(fù)合物,質(zhì)譜鑒定各亞基分子量分別為123.5 KDa(BmPOL-1)、49.1 KDa(Bm POL-2)和52.6 KDa(BmPOL-3)。至此,本研究通過使用MultiBac系統(tǒng)成功制備了具有酶學(xué)活性的家蠶DNA聚合酶δ復(fù)合物,使大量且快速獲取家蠶DNA聚合酶δ復(fù)合物用于深入研究家蠶DNA復(fù)制以及DNA損傷修復(fù)成為可能。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78;Q55

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 阮細(xì)玲;吳瓊;黃怡;李永繼;徐恒;;DNA聚合酶δ與腫瘤的關(guān)系[J];臨床與實驗病理學(xué)雜志;2012年12期

2 丁一宗;李稻;;DNA聚合酶γ基因突變研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2012年03期

3 吳亞松;陳德喜;吳昊;;常見DNA聚合酶γ基因突變和線粒體疾病[J];中國病原生物學(xué)雜志;2009年09期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 向仲懷;夏慶友;周澤揚;魯成;;家蠶基因組框架圖及生物學(xué)分析[A];當(dāng)代昆蟲學(xué)研究——中國昆蟲學(xué)會成立60周年紀(jì)念大會暨學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2004年

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本文編號：1286215