發(fā)布時(shí)間：2017-12-13 16:23

  本文關(guān)鍵詞：變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸激酶基因的克隆表達(dá)及其在葡萄糖代謝中的作用研究

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【摘要】：2-酮基葡萄糖酸(2-ketogluconic acid,2KGA)是一種重要的有機(jī)酸,廣泛應(yīng)用于食品、制藥、化妝品、環(huán)保等領(lǐng)域,目前主要作為食品抗氧化劑異維生素C(D-異抗壞血酸)及其鈉鹽合成的前體。本論文以國(guó)內(nèi)2KGA生產(chǎn)的主要工業(yè)用菌變形假單胞菌JUIM01為研究材料,采用PCR技術(shù)克隆該菌株的2-酮基葡萄糖酸激酶(2-ketogluconate kinase,Kgu K)的全長(zhǎng)基因,并利用生物信息學(xué)在線分析工具和相關(guān)軟件明確KguK蛋白的生物學(xué)信息。在此基礎(chǔ)上,分別采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)和基因的無(wú)痕敲除技術(shù),分析KguK蛋白在變形假單胞菌葡萄糖代謝中的作用,為2KGA工業(yè)化生產(chǎn)菌株的改造提供相關(guān)的理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:(1)采用PCR技術(shù),從變形假單胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)JUIM01中克隆了KguK的全長(zhǎng)基因(kguK)。在此基礎(chǔ)上,分別構(gòu)建了重組菌株Escherichia coli BL21(DE3)/pET-28a-kguK、BL21(DE3)/pET-42a-kguK、BL21(DE3)/pET-40b-kguK和Rosetta-gamiB(DE3)pLsS/pET-32a-kguK。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,KguK蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中,是一種由305個(gè)氨基酸殘基組成的、總平均親水指數(shù)較低的蛋白,存在著與pfkB家族蛋白類似的保守結(jié)構(gòu)域。IPTG誘導(dǎo)結(jié)果顯示,除E.coli BL21(DE3)/pET-40b-kguK外,其他的重組菌株均可表達(dá)KguK蛋白,但均以包涵體形式存在于細(xì)胞中。對(duì)E.coli BL21(DE3)/pET-28a-kguK菌株表達(dá)的重組KguK蛋白包涵體進(jìn)行的復(fù)性結(jié)果顯示,重組蛋白KguK復(fù)性后的酶活為15.3 U/L。(2)采用基因合成技術(shù),獲得了密碼子優(yōu)化的kguK基因。然后,采用酶切、無(wú)縫克隆、電轉(zhuǎn)化和同源重組等技術(shù),分別構(gòu)建了胞外分泌表達(dá)型和胞內(nèi)表達(dá)型的重組菌株P(guān)ichia pastoris X-33/pPICZαB-kguK和X-33/pPICZ(Δα)B-kguK。SDS-PAGE和Western-blot分析結(jié)果顯示,在甲醇的誘導(dǎo)下,Kgu K蛋白在上述重組菌株中均可得到表達(dá),但其胞外分泌量極低。采用親和層析、透析和超濾濃縮等方法,對(duì)上述菌株表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行了分離純化,獲得了比活為736.8 U/g的KguK。(3)根據(jù)P.plecoglossicida JUIM01的kgu操縱子的序列信息,采用重疊PCR技術(shù)構(gòu)建了kguK基因缺失的片段ΔkguK;采用分子克隆技術(shù),構(gòu)建了重組敲除質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔkguK。在此基礎(chǔ)上,以卡那霉素和蔗糖致死基因sacB作為篩選標(biāo)記,對(duì)變形假單胞菌JUIM01的kguK基因進(jìn)行無(wú)痕敲除,構(gòu)建了kguK基因缺失菌株P(guān).plecoglossicida JUIM01-Δkgu K。P.plecoglossicida JUIM01和P.plecoglossicida JUIM01-ΔkguK的2KGA發(fā)酵特性差異的比對(duì)結(jié)果顯示,在發(fā)酵后期,JUIM01菌株和JUIM01-ΔkguK菌株均可利用發(fā)酵目的產(chǎn)物2KGA,但JUIM01-ΔkguK菌株的2KGA消耗率相對(duì)較低,說(shuō)明在P.plecoglossicida JUIM01胞內(nèi)可能還存在著其他的2KGA代謝途徑。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

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本文編號(hào)：1285801