發(fā)布時間：2017-12-12 16:12

  本文關鍵詞：腺苷酸激酶ak4敲除對雄性斑馬魚生殖細胞凋亡的影響

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【摘要】：生命的延續(xù)和發(fā)展依賴于生物的繁殖。有關生殖發(fā)育的研究受到越來越多的關注。斑馬魚作為一種常用的模式生物,受精和發(fā)育均在體外進行,方便研究。除此之外,作為脊椎動物,斑馬魚的基因同人類基因的功能相似,組織器官的結構同源。因此,在現代生命科學研究的各個方面廣泛使用。腺苷酸激酶(Adenylate kinase,AK)是遍及于植物、動物和微生物體內的一種單體酶,在需要高水平腺苷三磷酸(Adenosine triphosphate,ATP)的細胞中大量存在。近年來,人們在細胞凋亡過程中發(fā)現有AK的遷移和酶活的變化,且AK缺陷與人類很多疾病的發(fā)生都有直接關系。有文獻報道,人的AK1-4、6-7均表達于睪丸和附睪,AK5僅表達于附睪;AK6還表達于精子尾部。但在雄性生殖系統(tǒng)中AK的作用目前知道的還很少。實驗室合作者前期研究發(fā)現,在人類弱精癥患者中,AK相關基因表達異常。因此,本論文采用CRISPR/Cas9技術,敲除斑馬魚ak4,研究其對雄性生殖系統(tǒng)中ATP含量和AMP/ATP比例的影響以及對雄性生殖細胞凋亡的影響,為進一步治療與此相關的疾病提供理論支持。通過序列比對和進化分析,發(fā)現斑馬魚各Ak彼此之間的序列一致性僅為8.5%,說明斑馬魚ak家族基因在序列、功能上有很大分化。qPCR技術分析斑馬魚各ak在胚胎發(fā)育早期和成體各組織器官的表達,發(fā)現斑馬魚ak7a既有有母源表達,又有合子表達;其他ak以合子表達為主;在精巢中表達的ak有ak1、ak4、ak6、ak7a、ak7b、ak8和ak9。由此明確了 ak各亞型在斑馬魚的表達情況,為針對特定的功能研究進行基因敲除提供了線索。隨后采用CRISPR/Cas9技術,成功敲除斑馬魚腺苷酸激酶ak4基因,并篩選到純合突變體后代。用HPLC方法測定精巢中ATP、ADP、AMP的含量及AMP/ATP比例,結果表明,突變體精巢中ATP含量顯著減少,AMP含量未發(fā)生明顯變化,AMP/ATP比值升高。說明精巢中細胞的能量狀態(tài)發(fā)生了顯著變化。用TUNEL和FCM檢測,發(fā)現突變體精巢中細胞凋亡增多。結合其他文獻和本實驗結果,推測細胞中這種能量變化導致了 ak4突變體雄性生殖細胞凋亡。在8 h、24 h分別檢測,都發(fā)現ak4雄性突變體后代存活率下降,死亡率上升,推測是由于ak4突變后,細胞凋亡增加導致精子質量下降所致。突變體胚胎在發(fā)育早期下包慢,卵黃大,色素淺,身體短,發(fā)育滯后。結合ak4在早期發(fā)育中的表達,這顯示ak4也參與了早期胚胎發(fā)育過程。另外,還采用CRISPR/Cas9敲除了斑馬魚ak6和ak7a基因,制備了 F0代突變體。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q78;Q492

【參考文獻】

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1 王明霞;任雷鳴;王紅芳;;細胞外ATP和腺苷及其受體與細胞凋亡[J];中國藥理學通報;2006年09期

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本文編號：1283119