本文關(guān)鍵詞：珙桐CesA基因的克隆及在種子發(fā)育中的表達(dá)分析

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【摘要】：珙桐又名鴿子樹,是我國特有的一級(jí)保護(hù)珍稀瀕危植物,第三紀(jì)古熱帶植物孑遺種,具有很高的學(xué)術(shù)研究價(jià)值和觀賞價(jià)值。其種子繁殖能力弱,自然更新困難,休眠期長,對(duì)生長環(huán)境要求苛刻。種子敗育嚴(yán)重是制約珙桐有性繁殖的重要原因之一,這種現(xiàn)象在許多木本植物中是普遍存在的。目前對(duì)于這種自發(fā)的種子敗育機(jī)制缺乏分子水平上的解釋。本實(shí)驗(yàn)前期通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,已建立珙桐果實(shí)和種子的unigene庫,以上述unigene庫作為參考序列,通過數(shù)字表達(dá)譜分析,在珙桐正常種子和敗育種子中篩選出2361個(gè)差異表達(dá)基因。其中我們發(fā)現(xiàn)纖維素合酶基因(CesM)在敗育種子中較正常種子呈現(xiàn)一致的顯著上調(diào)表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過分析纖維素合酶基因在珙桐種子發(fā)育過程中的表達(dá)模式,結(jié)合纖維素含量的測(cè)定,初步研究了珙桐中纖維素合酶的活性變化規(guī)律及在種子發(fā)育過程中所行駛的功能。并進(jìn)一步選擇了一個(gè)基因,通過對(duì)該基因的表達(dá)分析,克隆,蛋白表達(dá)和功能驗(yàn)證進(jìn)一步明確該基因的功能。本研究旨在挖掘珙桐基因資源,解析種子敗育的分子機(jī)制,為理解種子自發(fā)敗育的生物學(xué)意義提供理論基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容如下:1.珙桐纖維素合酶基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析在珙桐種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出14個(gè)纖維素合酶基因(CesA),共有22個(gè)轉(zhuǎn)錄本,在敗育種子中呈現(xiàn)一致的顯著上調(diào)表達(dá)。其中有7個(gè)基因在正常種子和敗育種子中表達(dá)差異顯著。2.纖維素合酶基因的表達(dá)分析qPCR檢測(cè)表明CesM基因在敗育種子中呈現(xiàn)一致的顯著上調(diào)表達(dá),挑選4個(gè)在敗育種子中顯著上調(diào)的CesM基因進(jìn)行表達(dá)分析,結(jié)果表明它們表達(dá)模式相似,在敗育種子中表達(dá)量均顯著高于正常種子,且在正常種子發(fā)育后期上調(diào)表達(dá)。將表達(dá)差異最顯著的c43681.graph_c0基因在珙桐不同組織中進(jìn)行表達(dá)分析,結(jié)果顯示c43681.graph_c0基因在花和果實(shí)等生殖器官中表達(dá)量較高,在葉和芽等營養(yǎng)器官中表達(dá)量較低,在敗育的種子中表達(dá)量最高。證明c43681.graph_c0基因在生殖器官中偏好表達(dá)。3.c43681.graph_c 基因的克隆及編碼產(chǎn)物特征分析設(shè)計(jì)引物將序列c43681.graph_c0基因進(jìn)行克隆獲得882bp片段,經(jīng)序列分析,其編碼產(chǎn)物包含292個(gè)氨基酸,具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,等電點(diǎn)為9.07,為堿性蛋白,與擬南芥纖維素合酶4號(hào)催化亞基同源性最高,含有在植物中特有的保守區(qū)域。4.目標(biāo)基因表達(dá)蛋白質(zhì)將成功構(gòu)建的pET28/CesA重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主大腸桿菌BL21中進(jìn)行原核表達(dá),使用SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析。通過對(duì)誘導(dǎo)條件的摸索,誘導(dǎo)時(shí)間為4 h、IPTG誘導(dǎo)濃度為1 mmol/L時(shí),纖維素合酶基因的表達(dá)量最大。5.基因功能驗(yàn)證將成功構(gòu)建的pBI121/CesA重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主農(nóng)桿菌中,利用花序浸染法將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化擬南芥,利用含有卡那霉素的培養(yǎng)基對(duì)收獲的種子進(jìn)行初步篩選,觀察轉(zhuǎn)入目標(biāo)基因的擬南芥植株的發(fā)育及第二代種子敗育情況。實(shí)驗(yàn)證明,未成功轉(zhuǎn)入目標(biāo)基因的植株也能出芽,但是在未長出真葉之前就會(huì)白化進(jìn)而死亡。
【學(xué)位授予單位】：中南林業(yè)科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q943.2;S792.99

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本文編號(hào)：1276353