本文關(guān)鍵詞：重組蛛絲蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及成絲機(jī)理研究

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【摘要】：蛛絲蛋白纖維作為一種優(yōu)異的生物學(xué)材料,在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域具有極大的潛在應(yīng)用價(jià)值,已有研究表明,重組蛛絲蛋白可用作血管、神經(jīng)導(dǎo)管及藥物載體等。目前重組蛛絲蛋白的研究主要集中于牽引絲、次壺腹腺絲及鞭毛狀腺絲蛋白質(zhì)。缺少梨狀腺絲蛋白(Pyriform Spidroin,PySp)的研究,尤其是大腹園蛛(A.ventricosus)梨狀腺絲蛋白的編碼序列至今仍未有報(bào)道,其生物學(xué)功能仍有待研究。為了解析大腹園蛛梨狀腺絲蛋白重復(fù)區(qū)(Rp)的功能、研究C端非重復(fù)區(qū)(CT)對(duì)成絲機(jī)理的影響、測(cè)試?yán)鏍钕俳z素蛋白的力學(xué)性能、獲得一種材料學(xué)性能優(yōu)良的重組蛛絲蛋白、為蛛絲蛋白的仿生提供理論依據(jù),本課題開(kāi)展了以下幾個(gè)方面的研究工作并都取得了較理想的研究結(jié)果。(1)以本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的大腹園蛛基因組為模板,設(shè)計(jì)特異性引物,克隆獲得一段蛛絲蛋白編碼序列,通過(guò)Blast比對(duì)分析,確定該序列包含大腹園蛛梨狀腺絲(Piriform spidroin,PySp)的一段完整重復(fù)區(qū)(Rp)的編碼序列,該序列為A.ventricosus的首條完整的PySp重復(fù)區(qū)基因序列,填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)A.ventricosus絲蛋白編碼基因克隆的空白,為絲蛋白基因的研究增填了新成員。(2)將PySp-Rp模塊與MiSp-NT/CT模塊重組構(gòu)建不具有CT功能模塊的MiSpNT-PySp Rp與具有完整功能模塊的MiSpNT-PySp Rp-MiSpCT重組蛛絲蛋白表達(dá)載體,進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和純化,并且優(yōu)化兩種蛋白的表達(dá)產(chǎn)量。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE膠和Western-blot鑒定,兩種重組蛛絲蛋白均能在大腸桿菌中表達(dá),表達(dá)產(chǎn)量較高,形成包涵體,經(jīng)過(guò)變性純化,獲得了純度較高的重組蛛絲蛋白。(3)采用圓二色譜(Circular dichroism,CD)測(cè)定不同pH下兩種重組蛛絲蛋白溶液的二級(jí)結(jié)構(gòu),計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)百分含量的變化;使用傅里葉紅外光譜(ATR-FTIR)測(cè)定兩種重組蛛絲蛋白凍干后的紅外光譜,計(jì)算其酰胺Ⅰ帶的各二級(jí)結(jié)構(gòu)百分含量。比較兩種蛛絲蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成發(fā)現(xiàn),隨著p H值降低,CT結(jié)構(gòu)域會(huì)引發(fā)PySp二聚化促進(jìn)其成絲;紅外光譜顯示,CT結(jié)構(gòu)域會(huì)增加PySp纖維的β折疊的百分含量,揭示了C端非重復(fù)區(qū)的存在可促進(jìn)絲素蛋白質(zhì)的組裝成絲,有利于提高固著絲纖維機(jī)械性能。(4)使用掃描電鏡(Scanning electron microscope,SEM)觀察濕紡獲得的MiSpNT-PySpRp-MiSpCT重組蛛絲蛋白纖維的表面形態(tài),顯示濕紡形成的MiSpNT-PySpRp-MiSpCT重組蛛絲蛋白纖維表面整體光滑,直徑整體均勻,類(lèi)似于天然蛛絲纖維形態(tài),直徑較天然蛛絲略粗,大約為20 um左右。綜上所述,本課題不僅填補(bǔ)了大腹園蛛梨狀腺絲蛋白重復(fù)區(qū)編碼基因的空白,同時(shí)以該基因?yàn)榛A(chǔ),進(jìn)一步深入研究了CT對(duì)蛛絲蛋白成絲機(jī)理的作用機(jī)制,后續(xù)還需要通過(guò)增加剪切力等條件進(jìn)一步探索該重組蛛絲纖維的力學(xué)性能。本研究為今后重組蛛絲蛋白的仿生提供了新的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：Q51

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 莫春麗;DICKO Cedric;邵正中;陳新;;時(shí)間分辨全反射紅外光譜對(duì)醋酸誘導(dǎo)絲蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變的研究[J];化學(xué)學(xué)報(bào);2009年22期

2 張超;張暉;趙曉燕;馬越;姚惠源;;使用圓二色性光譜和紅外光譜研究冬小麥麩皮抗凍蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[J];光譜學(xué)與光譜分析;2009年07期

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本文編號(hào)：1268350