本文關鍵詞：基于恒溫擴增的RNA檢測方法的研究

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【摘要】：核酸是遺傳變異的物質(zhì)基礎,是遺傳信息的載體,在蛋白質(zhì)生物合成中起十分重要的作用。生物體的遺傳、變異、生長發(fā)育、細胞分化等都與核酸密切相關。核酸包括核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)。其中RNA在合成蛋白質(zhì)的過程中起著非常重要的作用。同時,在生物分析、疾病診斷和食品安全中,RNA常作為分析標志物。因此,建立一種簡單、易于操作和靈敏快速的RNA檢測方法是生化領域中的主要目標,這也是本論文的主要研究內(nèi)容。本論文基于恒溫核酸擴增的檢測方法,構建了一種設計簡單的,快速的檢測RNA的新方法。在第二章中,本論文建立了變性泡介導的鏈交換擴增方法(Bubble-mediated strand exchange amplification,SEA)對RNA進行檢測。該方法類似于PCR,它僅僅利用一對引物和一種DNA聚合酶去實現(xiàn)變性,退火,延伸這3個循環(huán)步驟。SEA方法利用鏈呼吸作用來打開雙鏈,而不是通過熱變性。雙鏈DNA依靠呼吸作用產(chǎn)生DNA變性泡。在DNA變性泡中的單鏈區(qū)域設計引物進行等溫擴增,放大信號。同時,利用本課題組對Bst一系列聚合酶具有反轉錄活性的這一新發(fā)現(xiàn),在SEA反應體系中加入Bst 2.0 WarmstartTM可以實現(xiàn)RNA的一步法檢測。利用此方法對大腸桿菌16s RNA進行了檢測,檢測限可以達到100 amol,實時熒光檢測結果表明該方法對RNA檢測是可行的。通過加入10%的牛血清使反應體系復雜化,實驗結果顯示,該方法在較為復雜的體系中可以進行反應,驗證了該方法具有較強的抗干擾能力。由此表明,SEA是一種簡單,可以一步法檢測RNA的方法。在臨床應用和現(xiàn)場快速檢測方面具有重要意義。由于,SEA中雙鏈的解開是依靠DNA雙鏈自身的變性泡結構。因此,反應所需要的時間較長。為了減少反應所需要的時間,加快反應速率。在第三章中對SEA方法不斷進行改進。通過在SEA反應中加入了一條帶有限制性核酸內(nèi)切酶位點的引物鏈來加快反應速率。將SEA方法和指數(shù)等溫擴增方法連用,利用限制性核酸內(nèi)切酶將反應產(chǎn)生的雙鏈切成較短的兩個片段。在反應溫度下,較短的雙鏈自發(fā)打開的效率更快。但是,由于在體系中需要較高濃度的帶有內(nèi)切酶的引物鏈,從而產(chǎn)生了較高的非特異性導致實驗失敗。因此在本論文的第三章中對產(chǎn)生非特異性的原因進行了探討。綜上所述,本論文建立了一種簡單的RNA檢測新方法,實現(xiàn)了一步法檢測RNA。
【學位授予單位】：青島科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

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本文編號：1266087