本文關(guān)鍵詞：基于恒溫擴(kuò)增的RNA檢測方法的研究

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【摘要】：核酸是遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ),是遺傳信息的載體,在蛋白質(zhì)生物合成中起十分重要的作用。生物體的遺傳、變異、生長發(fā)育、細(xì)胞分化等都與核酸密切相關(guān)。核酸包括核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)。其中RNA在合成蛋白質(zhì)的過程中起著非常重要的作用。同時,在生物分析、疾病診斷和食品安全中,RNA常作為分析標(biāo)志物。因此,建立一種簡單、易于操作和靈敏快速的RNA檢測方法是生化領(lǐng)域中的主要目標(biāo),這也是本論文的主要研究內(nèi)容。本論文基于恒溫核酸擴(kuò)增的檢測方法,構(gòu)建了一種設(shè)計簡單的,快速的檢測RNA的新方法。在第二章中,本論文建立了變性泡介導(dǎo)的鏈交換擴(kuò)增方法(Bubble-mediated strand exchange amplification,SEA)對RNA進(jìn)行檢測。該方法類似于PCR,它僅僅利用一對引物和一種DNA聚合酶去實現(xiàn)變性,退火,延伸這3個循環(huán)步驟。SEA方法利用鏈呼吸作用來打開雙鏈,而不是通過熱變性。雙鏈DNA依靠呼吸作用產(chǎn)生DNA變性泡。在DNA變性泡中的單鏈區(qū)域設(shè)計引物進(jìn)行等溫擴(kuò)增,放大信號。同時,利用本課題組對Bst一系列聚合酶具有反轉(zhuǎn)錄活性的這一新發(fā)現(xiàn),在SEA反應(yīng)體系中加入Bst 2.0 WarmstartTM可以實現(xiàn)RNA的一步法檢測。利用此方法對大腸桿菌16s RNA進(jìn)行了檢測,檢測限可以達(dá)到100 amol,實時熒光檢測結(jié)果表明該方法對RNA檢測是可行的。通過加入10%的牛血清使反應(yīng)體系復(fù)雜化,實驗結(jié)果顯示,該方法在較為復(fù)雜的體系中可以進(jìn)行反應(yīng),驗證了該方法具有較強(qiáng)的抗干擾能力。由此表明,SEA是一種簡單,可以一步法檢測RNA的方法。在臨床應(yīng)用和現(xiàn)場快速檢測方面具有重要意義。由于,SEA中雙鏈的解開是依靠DNA雙鏈自身的變性泡結(jié)構(gòu)。因此,反應(yīng)所需要的時間較長。為了減少反應(yīng)所需要的時間,加快反應(yīng)速率。在第三章中對SEA方法不斷進(jìn)行改進(jìn)。通過在SEA反應(yīng)中加入了一條帶有限制性核酸內(nèi)切酶位點的引物鏈來加快反應(yīng)速率。將SEA方法和指數(shù)等溫擴(kuò)增方法連用,利用限制性核酸內(nèi)切酶將反應(yīng)產(chǎn)生的雙鏈切成較短的兩個片段。在反應(yīng)溫度下,較短的雙鏈自發(fā)打開的效率更快。但是,由于在體系中需要較高濃度的帶有內(nèi)切酶的引物鏈,從而產(chǎn)生了較高的非特異性導(dǎo)致實驗失敗。因此在本論文的第三章中對產(chǎn)生非特異性的原因進(jìn)行了探討。綜上所述,本論文建立了一種簡單的RNA檢測新方法,實現(xiàn)了一步法檢測RNA。
【學(xué)位授予單位】：青島科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳晶晶;;探究丙肝患者在治療過程中血清RNA與抗HCV定量檢測及其生化指標(biāo)的相關(guān)性[J];中國農(nóng)村衛(wèi)生;2017年04期

2 孟兆祥;張偉;檀建新;馬曉燕;;一種DNA擴(kuò)增的新技術(shù):利用熱穩(wěn)定的Bst DNA聚合酶驅(qū)動跨越式滾環(huán)等溫擴(kuò)增反應(yīng)[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2013年09期

3 周殿明;蔣健暉;沈國勵;俞汝勤;;基于核酸分子識別的電化學(xué)分析方法與應(yīng)用[J];電化學(xué);2011年03期

4 黃律;龍進(jìn)學(xué);翟少倫;劉長龍;張榮;袁世山;;豬細(xì)小病毒4型Taq Man熒光定量PCR方法的建立與應(yīng)用[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2011年01期

5 ;A Novel RT-LAMP Assay for Rapid and Simple Detection of Classical Swine Fever Virus[J];Virologica Sinica;2010年01期

6 張文慧;王偉利;鄭聰;劉明;錢愛東;;多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測H5、H7和H9亞型禽流感病毒的研究[J];華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2009年03期

7 鄒亞偉;封志純;胡斌;喬英颯;吳梓梁;陳福雄;葉鐵真;;新型Taq Man-MGB探針實時熒光定量PCR檢測人類mdr1基因[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2006年04期

8 孫非,肖蘭,劉志屹,張淑芹,劉建偉,李忠誼,許守民;限制性內(nèi)切酶分析法在柯薩奇B組病毒檢測及分型中的應(yīng)用[J];中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志;2004年01期

9 符征,汪吉寶;Northern印跡法檢測喉鱗狀細(xì)胞癌中表皮生長因子受體mRNA的表達(dá)[J];臨床耳鼻咽喉科雜志;2002年12期

10 邱廣斌,邱廣蓉,富偉能,孫開來;反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測端粒酶催化蛋白亞單位mRNA[J];中國實驗診斷學(xué);2001年06期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 湯丹;新型生物傳感器的研究及其在核酸和蛋白質(zhì)檢測方面的應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2011年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 林彩琴;基于滾環(huán)擴(kuò)增的目視法核酸檢測技術(shù)[D];浙江大學(xué);2013年

2 申志勇;PCR引物特異性評估體系及多重PCR引物設(shè)計系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2009年

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本文編號：1266087