本文關(guān)鍵詞：阿魏酸酯酶基因的克隆、改造及生物信息學(xué)分析

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【摘要】：阿魏酸酯酶屬于半纖維素降解酶系,它可以將多糖-多糖、多糖-木質(zhì)素之間的酯鍵水解,有利于水解細(xì)胞壁的組成物質(zhì)多糖釋放木質(zhì)素。阿魏酸酯酶在生物能源、食品、制漿造紙和生物合成等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用價值。目前,阿魏酸酯酶的酶活力、反應(yīng)條件和穩(wěn)定性等方面仍有較大提升空間,并且市場上成熟的商品化阿魏酸酯酶制劑還比較少,沒有大規(guī)模的應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中,因此對阿魏酸酯酶基因的克隆、改造的研究有很重要的意義。酶蛋白的異源表達(dá)常形成包涵體且不具有生化活性。本研究通過在棒曲霉阿魏酸酯酶基因加入融合標(biāo)簽麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)標(biāo)簽等,提高大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)產(chǎn)物的溶解性,并對其活性進行分析。研究表明,加入融合標(biāo)簽的阿魏酸酯酶對阿魏酸乙酯均無分解能力,但加入麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)的阿魏酸酯酶具有D型阿魏酸酯酶的表征。目前,這些添加融合標(biāo)簽的重組質(zhì)粒還在進一步的研究之中。本研究還利用生物信息學(xué)軟件對棲瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola23)的雙功能木聚糖酶-阿魏酸酯酶的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)以及進化歷史等進行深入分析。通過同源比對確定木聚糖酶和阿魏酸酯酶的功能區(qū)段,為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。此外,為了獲得活力高、穩(wěn)定性好的阿魏酸酯酶,本研究成功從瘤胃普雷沃氏菌基因組中克隆雙功能木聚糖酶-阿魏酸酯酶基因并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá),并對雙功能木聚糖酶-阿魏酸酯酶酶學(xué)性質(zhì)進行初步研究。結(jié)果表明,該酶的最適溫度在35℃-40℃之間,最適PH 7.0左右,各種溶液對酶活的影響均不相同。為了明確雙功能酶的催化機制和結(jié)構(gòu),本研究通過生物信息學(xué)分析和PCR技術(shù)將雙功能酶的兩個部分克隆并對其酶學(xué)性質(zhì)進行研究。結(jié)果表明,酶的最適條件基本沒有發(fā)生變化,但分離后的單功能酶活力均下降,阿魏酸酯酶部分喪失分解阿魏酸乙酯能力。為了提高阿魏酸酯酶活性和穩(wěn)定性,本研究還對阿魏酸酯酶進行了改造,分別在序列前加入17個氨基酸、信號肽和截短一個結(jié)構(gòu)域。對改造后的阿魏酸酯酶的酶學(xué)性質(zhì)也做了研究。結(jié)果表明,截短后的阿魏酸酯酶喪失生物學(xué)活性;加長17個氨基酸、信號肽的阿魏酸酯酶的最適條件基本無變化,而酶活性進一步降低。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q55;Q811.4

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