本文關(guān)鍵詞：嗜鹽古生菌溫和病毒SNJ1溶源裂解調(diào)控機理的研究

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【摘要】：對于溫和病毒而言,其溶源-裂解選擇的調(diào)控貫穿著整個病毒侵染過程的生命周期。人們對細(xì)菌病毒的溶原裂解調(diào)控機制已有較深入的理解,但對極端環(huán)境下古生菌病毒-宿主相互作用關(guān)系,特別是針對嗜鹽古生菌病毒卻知之甚少。SNJ1是存在于嗜鹽古生菌Natrinema sp.J7-1細(xì)胞內(nèi)的溫和病毒,其衣殼結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)二十面體球狀,含脂質(zhì)內(nèi)膜,具有獨特的分類地位,是新的病毒科——球脂狀病毒科(Sphaerolipoviridae)β屬的模式病毒株。與早期發(fā)現(xiàn)的兩株頭尾狀且基因同源性極高的嗜鹽古生菌溫和病毒φH和φCH1相比,SNJ1無論是在結(jié)構(gòu)還是基因排布上都與它們存在明顯差異。SNJ1的前病毒以環(huán)狀雙鏈質(zhì)粒DNA(pHH205)的形式存在于宿主細(xì)胞中。它不能侵染J7-1菌株,但侵染不攜帶質(zhì)粒的Natrinemasp.CJ7菌株時可產(chǎn)生噬菌斑,也可以較高比例形成溶源菌,即從CJ7菌株變成J7-1菌株,說明存在著一個控制該病毒選擇溶源或裂解途徑的調(diào)控機制。類似于經(jīng)典的溫和病毒λ噬菌體,SNJ1也可被絲裂霉素C(Mitomycin C,MMC)誘導(dǎo)進(jìn)入裂解途徑,但其基因組中的預(yù)測蛋白均與已知的CⅠ、CⅡ類似蛋白無同源性,暗示它可能采取新的策略來建立或維持溶源狀態(tài)。實驗室前期曾基于SNJ1病毒基因組和大腸桿菌復(fù)制區(qū)成功構(gòu)建了E.coli-Natrinemasp.J7全長穿梭載體pYC-S。本研究對CJ7/pYC-S用MMC進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)其裂解液能在CJ7鋪制的雙層平板上同時產(chǎn)生數(shù)量不一的空斑和濁斑,而攜帶野生型SNJ1前病毒(pHH205)的J7-1菌株經(jīng)同樣處理后形成的噬菌斑均為濁斑;之后對濁斑病毒、空斑病毒及野生型SNJ1病毒的侵染能力進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)空斑病毒裂解宿主的能力較野生型SNJ1顯著增強,而濁斑病毒的情況則與野生型SNJ1類似,對宿主細(xì)胞生長的影響也無明顯變化;挑取一定數(shù)量的這兩種噬菌斑進(jìn)行測序鑒定,發(fā)現(xiàn)空斑病毒均部分缺失了 orf4區(qū)域(293-499bp處),而濁斑病毒基因組的orf4區(qū)域則保持完整。轉(zhuǎn)錄起始位點分析實驗排除了該區(qū)域?qū)ο掠位蜣D(zhuǎn)錄情況的直接影響,說明orf4或其編碼產(chǎn)物可能與病毒早期溶源裂解的選擇調(diào)控有關(guān)。進(jìn)一步利用pYC-S載體進(jìn)行orf4基因的定向改造,發(fā)現(xiàn)攜帶orf4缺失突變體的CJ7菌株經(jīng)MMC誘導(dǎo)后均只能產(chǎn)生空斑病毒,證明orf4確實與SNJ1溶源裂解調(diào)控過程直接相關(guān);此外,和野生型SNJ1病毒感染CJ7菌株時可以較高比例選擇走溶源化道路的現(xiàn)象不同,經(jīng)多次嘗試均未分離篩選到空斑病毒感染CJ7菌株形成的溶源菌,說明orf4很可能是決定SNJ1早期溶源/裂解選擇過程中溶源化建立的關(guān)鍵因素。另一方面,利用基于J7染色體復(fù)制區(qū)構(gòu)建的Natrinemasp.J7-E.coli穿梭載體pFJ6在CJ7-F菌株(pyrF缺失的尿嘧啶缺陷菌株)中表達(dá)orf4基因。發(fā)現(xiàn)該重組菌株(CJ7/pFJ6-1-656)和J7-1菌株一樣,可徹底抑制SNJ1的侵染,無法形成噬菌斑。進(jìn)一步對orf4進(jìn)行分段表達(dá),發(fā)現(xiàn)僅表達(dá)gp4N端33個氨基酸即可賦予宿主對SNJ1病毒產(chǎn)生"免疫性"。有意思的是,SNJ1感染重組菌株CJ7/pFJ6-1-656時可篩選到同時攜帶PFJ6-1-656和pHH205的溶源菌株。對該溶源菌株的質(zhì)粒穩(wěn)定性和病毒誘導(dǎo)釋放曲線進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn),orf4基因的額外表達(dá)并未對SNJ1前病毒基因組(PHH205)的復(fù)制、DNA的分配及病毒的釋放產(chǎn)生明顯影響,側(cè)面反映orf4可能是通過抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞從而幫助宿主建立超感染免疫。綜上所述,本研究通過一系列遺傳學(xué)實驗,最終發(fā)現(xiàn)SNJ1基因組上orf4(499-293)的預(yù)測編碼大小為68個氨基酸的蛋白gp4同時參與了 SNJ1早期溶源途徑的選擇和宿主超感染免疫性的建立。進(jìn)一步對J7-1經(jīng)MMC誘導(dǎo)前后orf4及其相鄰基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)orf4和orf5-6的轉(zhuǎn)錄水平并不受MMC的影響,且orf4誘導(dǎo)前后的轉(zhuǎn)錄水平一直處于高水平的狀態(tài);另外,基于PSI-BlastP和HHpre對于orf4預(yù)測編碼蛋白gp4進(jìn)行序列分析,發(fā)現(xiàn)gp4與一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及毒素-抗毒素系統(tǒng)(Toxin-antitoxin system,TAsystem)系統(tǒng)中的抗毒素蛋白具有序列相似性。不僅如此,gp4和這些相似性蛋白的二級結(jié)構(gòu)均被預(yù)測或證實包含SpoVT-AbrB結(jié)構(gòu)域,類似于AbrB-like Swapped Hairpin結(jié)構(gòu),由一個α螺旋連接一對β發(fā)夾結(jié)構(gòu)組成。因此,gp4很有可能是控制SNJ1進(jìn)行溶源、裂解選擇的關(guān)鍵調(diào)控因子,甚至是一個對病毒多個基因進(jìn)行調(diào)控的全局調(diào)控因子。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q93

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本文編號：1265697