本文關(guān)鍵詞：駱駝天然單域重鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建及抗萊克多巴胺納米抗體的初步篩選

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【摘要】：駱駝免疫系統(tǒng)里的一種天然缺失輕鏈的僅由重鏈組成的抗體,稱為重鏈抗體或納米抗體。相對(duì)于傳統(tǒng)抗體,納米抗體獨(dú)特的結(jié)構(gòu),使其具有分子量小、可溶性好等特性,在病原的檢測(cè)、食品安全分析等領(lǐng)域被普遍應(yīng)用。納米抗體與抗原結(jié)合功能與全長(zhǎng)抗體同等,可以取代全長(zhǎng)抗體用于RAC的免疫學(xué)檢測(cè),建立可靠性高的免疫學(xué)檢測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)的研究目的在于構(gòu)建駱駝天然重鏈抗體文庫(kù),并篩選出抗RAC的噬菌體顆粒。萊克多巴胺(Ractopamine,RAC)是一種屬于苯酚胺類的β-腎上腺素興奮劑。RAC易在動(dòng)物組織中積聚殘留,人食用后可造成頭疼、胸悶等毒副作用。目前,歐盟、中國(guó)等組織和國(guó)家都將RAC列為違禁物,禁止其在畜禽身上使用。因此,畜產(chǎn)品中萊克多巴胺的快速準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)食品安全具有重要意義。本論文的主要內(nèi)容和結(jié)果如下:1.駱駝天然單域重鏈抗體噬菌體展示文庫(kù)的構(gòu)建與鑒定從健康駱駝外周血淋巴細(xì)胞中提取其RNA,經(jīng)鑒定RNA完整性良好。以RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR擴(kuò)增駱駝重鏈抗體可變區(qū)基因,將酶切后基因與噬菌粒載體pCANTAB5E連接后電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1。經(jīng)文庫(kù)鑒定得知,抗體庫(kù)重組率大約是90%,計(jì)算得抗體文庫(kù)的庫(kù)容量約為107cfu/mL。隨機(jī)挑取單克隆測(cè)序,抗體庫(kù)多樣性良好,可用于后續(xù)淘選研究。2.萊克多巴胺人工抗原的合成與鑒定利用1,4-丁二醚法制備RAC-OVA人工抗原,混合酸酐法制備RAC-BSA人工抗原,分別經(jīng)紫外光譜掃描法和SDS-PAGE凝膠電泳法鑒定,合成的人工抗原的吸收峰出現(xiàn)偏移現(xiàn)象,且偶聯(lián)物的分子量比載體蛋白的分子量偏大。證明人工抗原RAC-OVA、RAC-BSA偶聯(lián)成功。3.抗萊克多巴胺納米抗體重組噬菌體的篩選與鑒定用人工抗原RAC-BSA從噬菌體展示抗體庫(kù)中篩選出能表達(dá)抗RAC特異性納米抗體的重組噬菌粒,取篩選得到的陽(yáng)性噬菌體擴(kuò)增純化后,誘導(dǎo)表達(dá)獲得的可溶性重組納米抗體粗提物,并進(jìn)一步通過(guò)ELISA檢測(cè)納米抗體粗提物,經(jīng)鑒定其具有抗原結(jié)合能力。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)已成功構(gòu)建駱駝天然單域重鏈?zhǔn)删w展示抗體庫(kù),并從抗體庫(kù)中篩選出抗萊克多巴胺的噬菌體顆粒,為抗萊克多巴胺納米抗體的表達(dá)和RAC的免疫學(xué)檢測(cè)奠定了基礎(chǔ),天然噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建為后續(xù)淘選其他針對(duì)特定抗原的納米抗體奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78

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