本文關(guān)鍵詞：細(xì)菌耐熱賴氨酸氨肽酶畢赤酵母表達(dá)及發(fā)酵優(yōu)化

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【摘要】：氨肽酶(Aminopeptidase,APs)是一類可以水解多肽鏈和蛋白質(zhì)N端氨基酸的蛋白酶。它可以作為一種風(fēng)味蛋白酶,去除蛋白水解液的苦味并同時提高水解液游離氨基酸含量,還可以用于醫(yī)療診斷和蛋白N端測序等。本文將銅綠假單胞菌NJ-814的一種耐熱賴氨酸氨肽酶基因(plap)克隆并轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115染色體上,實現(xiàn)該基因的分泌表達(dá),并進(jìn)行重組菌的發(fā)酵條件優(yōu)化、plap基因偏好優(yōu)化、重組賴氨酸氨肽酶(PLAP)純化、特性表征及應(yīng)用研究。單因素實驗優(yōu)化重組畢赤酵母搖瓶條件,最優(yōu)條件為:起始誘導(dǎo)時間為18h,誘導(dǎo)培養(yǎng)基初始pH為5.0、甲醇濃度1.5%、誘導(dǎo)溫度28℃、裝液量25mL/250mL、Co~(2+)濃度50μmol·mL~(-1)和山梨醇添加量9g·L~(-1)。最優(yōu)條件下,上清液酶活達(dá)到3.02U·mL~(-1),氨肽酶酶活提高了5.21倍。根據(jù)密碼子偏好性,優(yōu)化和合成全基因序列,成功實現(xiàn)優(yōu)化基因在畢赤酵母中的表達(dá),優(yōu)化后基因的表達(dá)水平與原始基因相比提高20.53%。在7 L發(fā)酵罐中對產(chǎn)賴氨酸氨肽酶重組畢赤酵母高密度發(fā)酵實驗進(jìn)行了摸索,初始誘導(dǎo)菌體量OD_(600)為400時開始誘導(dǎo),誘導(dǎo)84 h后上清液中氨肽酶酶活達(dá)到最高,為7.8U·mL~(-1),是搖瓶產(chǎn)酶水平的2.14倍。重組賴氨酸氨肽酶經(jīng)40%-60%鹽析處理,Hitrap Q HP陰離子交換層析和Superdex~(TM)75 10/300GL凝膠過濾層析分離,最終純化得到的氨肽酶比酶活為36.41 U·mg~(-1),回收率為4.79%,純化倍數(shù)為3.95。對重組賴氨酸氨肽酶特性研究發(fā)現(xiàn),該氨肽酶最適pH為9.0,在pH7.0-9.5之間穩(wěn)定性良好。該氨肽酶最適反應(yīng)溫度為80℃,在50-70℃保留2h,殘留活性在80%以上,具有良好的熱穩(wěn)定性。Ca~(2+)和Co~(2+)能夠促進(jìn)重組氨肽酶的活性,DTT、β-mercaptoethanol、Ni~(2+)及EDTA能夠強(qiáng)烈抑制重組酶活性,Mg~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、PMSF、Mn~(2+)對重組賴氨酸氨肽酶的活性影響較小,Co~(2+)能夠解除EDTA對氨肽酶的抑制作用。該氨肽酶水解Lys-pNA的能力最強(qiáng),同時能水解Leu-pNA和Arg-pNA。糖基化位點分析表明賴氨酸氨肽酶存在3個潛在的糖基化位點,去糖基化酶處理前后酶的分子量變化說明該氨肽酶部分糖基化,糖基化對底物特異性和pH穩(wěn)定性影響不大,但降低了該氨肽酶的溫度穩(wěn)定性。對重組賴氨酸氨肽酶的應(yīng)用進(jìn)行研究,考察堿性蛋白酶、賴氨酸氨肽酶以及雙酶復(fù)配水解酪蛋白的效果。與不加酶的空白對照相比,三種溶液中的游離氨基酸均含量顯著增加,分別為22.5倍、10.5倍和65倍。堿性蛋白酶與氨肽酶復(fù)配水解時,亮氨酸與賴氨酸含量最高,寡肽、小肽的含量明顯增加,其中180 Da以下的小肽含量占到22.76%,2000 Da以上的大分子基本被降解。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78;TQ925

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本文編號：1263373