本文關(guān)鍵詞：Ig樣結(jié)構(gòu)域?qū)κ葻狨ッ窽n0664的影響

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【摘要】：酯酶是一類能夠催化酯鍵水解的酶類,主要由CAP結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域兩部分構(gòu)成。一般情況下,CAP結(jié)構(gòu)域由α螺旋和一些loop環(huán)構(gòu)成,是酯酶家族中序列相似性較低的部分;催化結(jié)構(gòu)域則為典型的α/β水解酶折疊,是酯酶家族中的保守區(qū)域。CAP結(jié)構(gòu)域?qū)︴ッ感再|(zhì)的影響是目前研究的熱點。本文從嗜熱細(xì)菌Thermotoga naphthophila RUK-10的基因組中擴(kuò)增出嗜熱酯酶Tn0664的基因并對其蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析比對,結(jié)果表明,不同于普通酯酶的N端CAP結(jié)構(gòu)域,Tn0664具有獨特的免疫球蛋白(Ig)樣N端結(jié)構(gòu)域。通過構(gòu)建敲除N端結(jié)構(gòu)域的突變酶TnδIg0664和將Ig樣結(jié)構(gòu)域替換成普通CAP結(jié)構(gòu)域的重組酶E50664和E400664,來研究Ig樣結(jié)構(gòu)域?qū)︴ッ窽n0664性質(zhì)的影響。實驗結(jié)果表明,酯酶Tn0664的最適底物為對硝基苯酚丙酸酯,最適反應(yīng)溫度為95℃,最適pH值為9.5,對底物對硝基苯酚辛酸酯的Km值為4.5×10-4 m M,kcat值為477 s-1,而TnδIg0664的最適底物為對硝基苯酚醋酸酯,最適反應(yīng)溫度為80℃,最適pH值為10.0,對底物對硝基苯酚辛酸酯的Km值為4.7×10-2 m M,kcat值為39 s-1,切除Ig樣結(jié)構(gòu)域后酶與底物的親和性和催化效率同時降低,剩余酶活為4.4%,說明Ig樣結(jié)構(gòu)域參與了酶的催化過程,對底物識別過程起著調(diào)控作用。重組酶E50664和E400664的最適底物均為對硝基苯酚辛酸酯,最適溫度分別為60℃和50℃,最適pH值為10.5,對底物對硝基苯酚辛酸酯的Km值分別為3.9×10-1 m M和7.0×10-2 m M,kcat值分別為504 s-1和1192 s-1,更換CAP結(jié)構(gòu)域后的酶表現(xiàn)出更加廣泛的底物特異性和較低的嗜熱性,催化效率均高于去Ig樣結(jié)構(gòu)域的突變酶。這些結(jié)果充分說明了Ig樣結(jié)構(gòu)域?qū)S持酶的嗜熱性,底物特異性和活性有重要作用。酶的穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明,Tn0664在70℃,80℃和90℃條件下的半衰期分別為60 h,37 h和12 h,TnδIg0664在70℃和80℃下的半衰期分別為6 h和10min,在90℃條件下保溫10 min,酶的剩余活力已不足10%;在pH穩(wěn)定性實驗中,Tn0664,E50664和E400664的酶活在處理1 h和24 h的情況下沒有明顯的變化,而突變酶TnδIg0664的酶活則降低了約60%,由此可以看出Ig樣結(jié)構(gòu)域在維持酶的穩(wěn)定性方面扮演了重要角色。本文的研究工作初步闡釋了Ig樣結(jié)構(gòu)域?qū)︴ッ窽n0664的意義,同時,利用結(jié)構(gòu)域重組方式構(gòu)建的新酶也表現(xiàn)出不同的性質(zhì),豐富了酯酶的種類。但是,作為獨特存在于酯酶結(jié)構(gòu)中的Ig樣結(jié)構(gòu),其分子水平作用機制還需進(jìn)一步探索,以便給出更加完善的作用模型。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q55

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本文編號：1263255