本文關(guān)鍵詞：豬腺病毒多重PCR方法的建立及初步應(yīng)用

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【摘要】：豬腺病毒是于1964年在英格蘭首次被分離,此后,通過(guò)病毒分離和血清學(xué)調(diào)查逐步證明豬腺病毒在豬群中廣泛存在。但是腺病毒作為自然感染病例病原體的重要性以及豬腺病毒的危害和造成的經(jīng)濟(jì)損失,迄今為止尚不完全清楚。目前對(duì)豬腺病毒的診斷手段有病毒分離、直接免疫熒光實(shí)驗(yàn)、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、血凝,血凝抑制和病毒中和試驗(yàn)、分子生物學(xué)方法。病毒分離、直接免疫熒光實(shí)驗(yàn)這些診斷方法相對(duì)比較繁瑣,花費(fèi)的經(jīng)費(fèi)較多,檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),無(wú)法方便快捷地對(duì)豬腺病毒進(jìn)行大規(guī)模調(diào)查研究。目前國(guó)外和國(guó)內(nèi)都有學(xué)者用分子生物學(xué)方法對(duì)豬腺病毒進(jìn)行檢測(cè),不過(guò)PCR至今未成為豬腺病毒的常規(guī)檢測(cè)手段。本研究的目的是建立一種快速、簡(jiǎn)便、高靈敏度的豬腺病毒多重PCR檢測(cè)方法,為更好的了解豬腺病毒感染和傳播提供技術(shù)手段。豬腺病毒多重PCR方法的建立：首先從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載四個(gè)血清型PADV的基因序列,用DNAstar軟件對(duì)下載序列進(jìn)行同源性性分析,從不同血清型PADV各自的序列中找到型內(nèi)比較保守但血清型之間存在變異的區(qū)域,用Primer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。最后對(duì)PCR引物濃度、退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,并進(jìn)行敏感性和特異性分析。結(jié)果,4個(gè)血清型PADV中,PADV3和PADV5在保守的六鄰體部位分別設(shè)計(jì)了引物,PADV1在基因ORF1-5區(qū)域設(shè)計(jì)了引物,PADV4在E1B進(jìn)行了引物設(shè)計(jì)。各引物濃度在0.6umol、退火溫度55℃時(shí),多重PCR效果最佳；且通過(guò)對(duì)流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、藍(lán)耳病毒、杯狀病毒、豬流感病毒、星狀病毒的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)該多重PCR方法具有很好的特異性。豬腺病毒多重PCR方法的初步應(yīng)用：采用建立的多重PCR方法對(duì)豬場(chǎng)收集的318份豬肛門(mén)拭子,80份豬肺臟,173份豬鼻拭子,180份豬血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果肛門(mén)拭子的PADV檢測(cè)陽(yáng)性率為20.75%,鼻拭子的陽(yáng)性率為10.4%,血清的陽(yáng)性率為1.66%,肺臟陽(yáng)性率為7.5%。將檢測(cè)到陽(yáng)性樣品的PCR產(chǎn)物送公司進(jìn)行基因測(cè)序分析同樣證明了建立的多重PCR方法具有很好的特異性,可以用于豬腺病毒的檢測(cè),為豬腺病毒感染的調(diào)查和診斷提供了重要的技術(shù)支持。從檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在患病豬的感染率高于健康豬,豬在每個(gè)季節(jié)的感染率無(wú)明顯差別,飼養(yǎng)環(huán)境差的豬場(chǎng)感染率高于飼養(yǎng)環(huán)境好的。
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.651

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本文編號(hào)：1158683