發(fā)布時(shí)間：2017-06-01 05:07

  本文關(guān)鍵詞：基于碳納米管的慶大霉素免疫分析方法研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：慶大霉素是一類氨基糖苷類抗生素,在臨床治療和動(dòng)物養(yǎng)殖中有著廣泛應(yīng)用。過量的抗生素使用對(duì)人類和環(huán)境存在危害。由于環(huán)境樣本中慶大霉素含量很低,對(duì)分析方法靈敏度有較高要求。以酶聯(lián)免疫分析方法為代表的生物分析方法,具有靈敏度高、檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),成為環(huán)境中污染物快速分析的新方向。本文通過制備的慶大霉素單克隆抗體,初步建立了基于碳納米管免疫新方法。采用直接化學(xué)交聯(lián)法成功制備了免疫原GEN-BSA和包被原GEN-OVA,紫外掃描鑒定證明反應(yīng)產(chǎn)物交聯(lián)成功。用免疫原免疫小鼠,三只小鼠抗慶大霉素血清達(dá)到預(yù)期抑制要求,選取其中抑制率最高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合,細(xì)胞融合后用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法篩選出6株分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞分別為2G5D12、2G5F8、2G5E7、2G5D7、2G5F5G7、2G5F5H7,試驗(yàn)對(duì)六株雜交瘤分泌的抗體進(jìn)行亞型鑒定,結(jié)果顯示單克隆抗體重鏈均為IgG 2a型,輕鏈為K型。選取2G5D12細(xì)胞株制備腹水,通過體內(nèi)誘導(dǎo)法大量制備單克隆抗體,腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨法純化得到純化單克隆抗體。對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化,采用抗原抗體最佳工作濃度和最優(yōu)條件繪制競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線,根據(jù)擬合曲線計(jì)算得檢測(cè)限(IC90)為0.026 ng/mL,半數(shù)抑制(IC50)為0.095 ng/mL,線性范圍(IC80-IC20)為0.042~0.2438 ng/mL。2G5D12單克隆抗體除了對(duì)妥布霉素有0.31%的交叉反應(yīng)率,和鏈霉素、新霉素、卡那霉素、核糖霉素、阿米卡星的交叉反應(yīng)率均在0.01%以下。實(shí)驗(yàn)回收率范圍為74.3~126.8%,變異系數(shù)小于13.2%。試驗(yàn)穩(wěn)定性良好。對(duì)環(huán)境樣本慶大霉素含量進(jìn)行分析,江蘇大學(xué)環(huán)境水樣中慶大霉素含量在0.04~0.1 ng/mL,而土壤中慶大霉素含量中在0.115~0.167 ng/mL。牛奶樣品中,慶大霉素含量在0.832~1.075 ng/mL;在動(dòng)物組織中慶大霉素殘留量為1.946~3.577 ng/g,均未超出最高殘留限量。合成GEN-HRP,并采用兩種方法將二抗偶聯(lián)碳納米管;討論碳納米管合成產(chǎn)物非特異性結(jié)合;優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件后,選取2%BSA作為稀釋液,MWCNTs-PEG-GAM作為載體。建立了基于碳納米管的離心定量方法和過濾定性方法。離心定量法獲得慶大霉素抑制曲線,根據(jù)擬合曲線計(jì)算得檢測(cè)限(IC90)為0.048 ng/mL,半數(shù)抑制(IC50)為0.195 ng/mL,線性范圍(IC80~IC20)為0.080~0.512 ng/mL。實(shí)驗(yàn)測(cè)定四種樣品回收率和重復(fù)率,回收率范圍為60.1~135.4%,變異系數(shù)小于18.7%。試驗(yàn)穩(wěn)定性良好。過濾定性法在0.1 ng/L顏色變淺,1 ng/L顏色消失。對(duì)環(huán)境樣本慶大霉素含量進(jìn)行分析,江蘇大學(xué)環(huán)境水樣中慶大霉素含量在0.07~0.146 ng/mL,而土壤中慶大霉素含量在0.198~0.38ng/g;定性分析6、7、10號(hào)水樣,結(jié)果為陰性,9、11、13號(hào)土壤樣品為陽性。
【關(guān)鍵詞】：慶大霉素 單克隆抗體 免疫分析 碳納米管 環(huán)境殘留
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：X830
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 注釋表13-14
• 第一章 緒論14-24
• 1.1 環(huán)境中抗生素殘留現(xiàn)狀14-15
• 1.1.1 抗生素使用現(xiàn)狀14
• 1.1.2 環(huán)境中抗生素來源與分布14-15
• 1.2 慶大霉素研究現(xiàn)狀15-18
• 1.2.1 慶大霉素簡(jiǎn)介15-16
• 1.2.2 最大殘留限量及危害16
• 1.2.3 慶大霉素檢測(cè)方法16-18
• 1.3 碳納米管研究現(xiàn)狀18-22
• 1.3.1 碳納米管簡(jiǎn)介18-19
• 1.3.2 碳納米管毒性19
• 1.3.3 碳納米管應(yīng)用19-22
• 1.4 本文研究目的及內(nèi)容22-24
• 1.4.1 本文研究目的22
• 1.4.2 本文研究?jī)?nèi)容22-24
• 第二章 慶大霉素單克隆抗體的制備24-36
• 2.1 試驗(yàn)材料24-27
• 2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞24
• 2.1.2 主要試劑24-25
• 2.1.3 儀器及材料25
• 2.1.4 主要溶液配制25-27
• 2.2 試驗(yàn)方法27-31
• 2.2.1 慶大霉素免疫原合成27
• 2.2.2 慶大霉素包被原合成27
• 2.2.3 慶大霉素免疫原和包被原的鑒定27
• 2.2.4 動(dòng)物免疫27-28
• 2.2.5 免疫結(jié)果測(cè)定28
• 2.2.6 單克隆抗體的制備28-29
• 2.2.7 細(xì)胞融合29-30
• 2.2.8 融合細(xì)胞的培養(yǎng)及觀察30
• 2.2.9 陽性孔的篩選及亞克隆30
• 2.2.10 單克隆抗體亞型的鑒定30
• 2.2.11 雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇30-31
• 2.3 結(jié)果與討論31-34
• 2.3.1 慶大霉素人工抗原的合成及鑒定31-32
• 2.3.2 間接ELISA方法的建立32-33
• 2.3.3 細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的篩選33-34
• 2.3.4 單克隆抗體亞型的鑒定34
• 2.3.5 雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇34
• 2.4 結(jié)論34-36
• 第三章 慶大霉素ELISA方法的建立36-51
• 3.1 試驗(yàn)材料36-38
• 3.1.1 試驗(yàn)試劑36
• 3.1.2 試驗(yàn)儀器36-37
• 3.1.3 主要溶液配制37-38
• 3.2 試驗(yàn)方法38-43
• 3.2.1 腹水的制備38
• 3.2.2 單克隆抗體的純化38-39
• 3.2.3 抗原，抗體最佳工作濃度測(cè)定39
• 3.2.4 ELISA條件的優(yōu)化39-40
• 3.2.5 競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線的建立40-41
• 3.2.6 交叉反應(yīng)率的測(cè)定41
• 3.2.7 回收率及變異系數(shù)的測(cè)定41
• 3.2.8 環(huán)境中樣本采集及處理41-43
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論43-49
• 3.3.1 抗原，抗體最佳工作濃度43
• 3.3.2 ELISA優(yōu)化43-45
• 3.3.3 競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線45-46
• 3.3.4 交叉反應(yīng)率46-47
• 3.3.5 回收率及變異系數(shù)47-48
• 3.3.6 環(huán)境中樣本分析48-49
• 3.4 結(jié)論49-51
• 第四章 基于碳納米管慶大霉素免疫方法的建立51-67
• 4.1 試驗(yàn)材料51-53
• 4.1.1 試驗(yàn)試劑51
• 4.1.2 試驗(yàn)儀器51-52
• 4.1.3 主要溶液配制52-53
• 4.2 試驗(yàn)方法53-57
• 4.2.1 GEN-HRP的合成53
• 4.2.2 碳納米管的羧基化53-54
• 4.2.3 MWCNTs-GAM的合成54
• 4.2.4 MWCNTs-PEG-GAM的合成54-55
• 4.2.5 GEN-HRP的鑒定55
• 4.2.6 MWCNTs-GAM和MWCNTs-PEG-GAM的表征55-56
• 4.2.7 碳納米管非特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)56
• 4.2.8 基于碳納米管免疫新方法的建立56-57
• 4.2.9 回收率的測(cè)定57
• 4.2.10 環(huán)境中樣本采集及處理57
• 4.3 結(jié)果與討論57-65
• 4.3.1 GEN-HRP的合成與鑒定57-58
• 4.3.2 MWCNTs-GAM和MWCNTs-PEG-GAM的合成與鑒定58-59
• 4.3.3 碳納米管非特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)59-60
• 4.3.4 基于碳納米管免疫新方法的建立60-62
• 4.3.5 回收率及變異系數(shù)測(cè)定62
• 4.3.6 環(huán)境中樣本分析及方法比較62-65
• 4.4 結(jié)論65-67
• 第五章 結(jié)論與展望67-69
• 5.1 結(jié)論67
• 5.2 不足與展望67-69
• 參考文獻(xiàn)69-74
• 致謝74-75
• 在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及其他科研成果75

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