微生物在污染環(huán)境的生物修復(fù)方面具有重要作用,它們對環(huán)境污染物的降解是通過一系列酶來進(jìn)行的。因此,研究污染物降解過程中關(guān)健酶的作用機理,對于闡明微生物對污染物的生物降解過程以及生物修復(fù)機制具有重要意義。蛋白質(zhì)晶體學(xué)是利用X射線衍射技術(shù)對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析的一門學(xué)科,它能使我們從原子角度了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息,結(jié)合蛋白質(zhì)的功能特性,可以確定在實際催化過程中的功能基團及其作用方式,為定向改造提供重要信息。硝基苯是一種重要的化工原料和化學(xué)中間體,進(jìn)入環(huán)境的硝基苯會長期殘留在水體和土壤里,對人類健康造成嚴(yán)重的危害。本文以硝基苯代謝途徑中的脫氨酶AmnE作為研究對象,利用Ni-NTA親和層析及Resource Q離子交換層析對重組表達(dá)于大腸桿菌BL21 (DE3)中的AmnE蛋白進(jìn)行純化。利用懸滴氣相擴散法和商業(yè)結(jié)晶試劑盒進(jìn)行結(jié)晶條件的篩選和優(yōu)化,并在0.2 M KCl、23% PEG3350、0.2 M Bis-Tris pH 7.5的結(jié)晶條件下獲得了高分辨率的蛋白晶體。AmnE晶體的分辨率為2.09A,屬于正交晶系,空間群為C2221,晶胞參數(shù)為a= 63.23 A、b= 88.93 A、c= ...

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－７蜜白質(zhì)結(jié)晶過程示意圖??Ｋ．?１－７?Ｐｒｏｃｅｓｓ?ｏｆｒｏ化ｉｎ?ｃｒｓ化ｌｌｉｚａｔｉｏｎ??

的單晶的獲得是蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)解析的前提。蛋白質(zhì)結(jié)晶過程是一個有序化的過程，??即在溶液中處于隨機狀態(tài)的分子轉(zhuǎn)變成有序聚集的狀態(tài)。當(dāng)溶液達(dá)到過飽和狀態(tài)時，??蛋白質(zhì)牙可能開始結(jié)晶，如圖１－７。晶體生長包括晶核形成（包含１０至２００個分子的??聚集）和晶體長大（周圍的分子向晶核聚集）....

圖１－８晶體Ｘ射線巧射不意圖??

?使用接收器如ＣＣＤ記錄Ｘ射線散射的強度，Ｗ獲得與與晶體內(nèi)部的原子分布規(guī)律相??對應(yīng)的特有的衍射圖譜，如圖１－８。在衍射數(shù)據(jù)收集時，一般先收集幾幅衍射圖譜檢??查晶體的衍射質(zhì)量，如果出現(xiàn)衍射點弱、分辨率低、李晶等現(xiàn)象，就沒有必要繼續(xù)收??集數(shù)據(jù)。如果衍射質(zhì)量不錯，則進(jìn)行指標(biāo)化處理....

圖２－１蛋白質(zhì)的結(jié)晶方法??

初篩得到的晶體往往是微晶、奕晶或者衍射效果較差的晶體，所Ｗ需要對其初篩??的條件開展進(jìn)一步的優(yōu)化工作。??Ｕ）采用懸滴氣相擴散法（如圖２－１）進(jìn)行結(jié)晶條件的優(yōu)化具體操作步驟如下；??２６??

圖３－１?ＰＣ艮擴增產(chǎn)物??Ｆｉｇ．?３－１?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｆ?ＡｍｎＥ??

３．２．１?ＰＣ艮擴增??Ｗ公司合成的ａｍｎＥ基因作為模板，應(yīng)用設(shè)計的特異性引物（如表２－３），進(jìn)行??．Ｋ：民擴増，其產(chǎn)物經(jīng)１％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖３－１。??Ｍ?１?■??６０００?ｂｐ－＾１??１０００?ｂｐ?－？接造皆?Ｉ??圖３－１?ＰＣ艮擴增產(chǎn)物??Ｆｉｇ．?....

本文編號：4037916